Oblasti výzkumu

1.Genetická analýza spontánní hypertenze
2.Genetická analýza dalších rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění, včetně dyslipidémie a inzulinové rezistence.

Nejvýznamnější výsledky

Genetická izolace oblasti chromozomu 4, asociované s hypertenzí, inzulinovou rezistencí a dyslipidémií u spontánně hypertenzních potkanů: vlivy deficience CD36.
U pacientů s esenciální hypertenzí je často zjišťována koincidence metabolických rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění. Spontánně hypertenzní potkani kmene SHR, nejčastěji používaný model esenciální hypertenze, mají rovněž řadu abnormalit metabolizmu uhlovodíků a tuků. Pomocí vazebných studií bylo nedávno zjištěno, že genetické determinanty, podmiňující krevní tlak a rezistenci izolovaných tukových buněk k účinkům inzulinu a katecholaminů, by mohly být lokalizovány v jediné oblasti chromozomu 4. Pro ověření této hypotézy a pro testování zda tyto genetické determinanty ovlivňují také systemickou inzulinovou rezistenci a dyslipidémii, jsme vytvořili nový kongenní kmen přenesením odpovídajícího úseku chromozomu 4  z kmene Brown Norway (BN) na genetické pozadí kmene SHR. Kongenní kmen (SHR-4) vykazoval významně snížený systolický krevní tlak měřený radiotelemetricky, sníženou inzulinovou rezistenci a nižší hladiny sérových triglyceridů a volných mastných kyselin.

Analýza SHR-4 kongenního kmene pak umožnila dosáhnout významného pokroku při výzkumu genetických faktorů, podmiňujících defektní metabolizmus uhlovodíků a tuků u kmene SHR. Fluorescenčně značené cDNA sondy, syntetizované z poly(A) mRNA, vyizolované z tukové tkáně kmenů SHR, BN a SHR-4 kongenních potkanů, byly aplikovány na cDNA biočipy, které obsahovaly přibližně 10000 individuálních cDNA klonů. Klony, kódující CD36 potkana vykazovaly u kmene SHR silně zredukované hybridizační signály (o více než 90%) ve srovnání s kmeny BN a SHR-4. Pomocí RT-PCR byla určena celá kódující sekvence CD36 u kmenů SHR, WKY a BN a bylo nalezeno mnoho sekvenčních variant, z nichž 11 podmiňovalo záměny aminokyselin. Sedm z těchto mutací pak bylo nalezeno v exonu 6. Navíc byl celý 3`-netranslatovaný konec SHR alely zcela odlišný ve srovnání s CD36 alelami kmenů WKY a BN. Pomocí vazebné analýzy s využitím HinfI RFLP PCR produktů, získaných amplifikací genomové DNA, byl CD36 gen zmapován na chromozom 4. Tento polymorfizmus odhalil u kmenů WKY a BN neočekávaný další fragment DNA, takže vypadaly jako heterozygoti. Tento nález, spolu s velkým počtem sekvenčních variant, odhalených mezi dvěma úzce příbuznými kmeny, jako jsou SHR a WKY, naznačil možnost duplikace CD36 u kmenů WKY a BN a delece u kmene SHR. Tato hypotéza byla následně potvrzena pomocí Southern blot analýzy. S využitím sond z oblasti exonu 6 a ze 3`-netranslatovaného konce CD36 alely kmene WKY, byl u kmene SHR pozorován pouze jediný restrikční fragment, zatímco nález dalších DNA fragmentů u kmenů WKY a BN potvrdil přítomnost alespoň jedné další kopie CD36 genu u těchto kmenů.

Pro zjištění, zda transkripcí CD36 genu kmene SHR vzniká funkční protein, jsme provedli Western blot analýzu. Zjistili jsme, že plazmatické membrány z tukové tkáně kmenů WKY a BN obsahovaly podstatné množství CD36, zatímco u kmene SHR nebyl detekován žádný CD36 protein. Podobný výsledek byl získán i u srdečního svalu. CD36 kóduje klíčový protein pro transport mastných kyselin přes buněčné membrány. Poruchy metabolizmu mastných kyselin jsou považovány za potenciálně důležité determinanty inzulinové rezistence. Celkově lze shrnout, že tyto nálezy poskytly nepřímé důkazy pro významnou roli CD36 při determinaci poruch metabolizmu uhlovodíků a lipidů u kmene SHR.

Transgenní komplementace defektního CD36 je asociovaná s větší citlivostí k účinkům inzulinu a se sníženou koncentrací sérových mastných kyselin.

Pro testování hypotézy, že CD36 je jedním z hlavních genů, podmiňujících poruchy metabolizmu uhlovodíků a tuků u kmene SHR, jsme použili komplementační analýzu pomocí vytvoření dvou nových SHR transgenních linií, SHR/Ola-TgN(EF1aCD36)10Ipcv a  SHR/Ola-TgN(EF1aCD36)19Ipcv (zkráceně označené SHR-TG10 a SHR-TG19), což nám umožnilo přímo testovat úlohu mutovaného CD36 genu při patogenezi hypertenze a poruch metabolizmu glukózy a mastných kyselin. Transgenní exprese normálního CD36 genu u kmene SHR, který nese mutantní CD36, indukovala významné změny v metabolizmu mastných kyselin, které byly asociovány se zlepšením glukózové tolerance a citlivosti k účinkům inzulinu. U SHR-TG10 a SHR-TG19 transgenních potkanů s normálním CD36 genem, krmených dietou s vysokým obsahem fruktózy, došlo k významnému snížení hladin sérových mastných kyselin ve srovnání s kmenem SHR, který má mutantní CD36. Pomocí orálního testu tolerance ke glukóze bylo zjištěno, že obě transgenní linie byly významně tolerantnější ve srovnání s kmenem SHR. Transgenní linie neměly významně odlišné hladiny sérového inzulinu, avšak inzulinem stimulovaná inkorporace glukózy do glykogenu v bráničním svalu byla významně vyšší u obou transgenních linií, než u kmene SHR. Přestože obě transgenní linie vykazovaly srovnatelné zlepšení tolerance ke glukóze a snížení sérových mastných kyselin, pouze u linie SHR-TG19 došlo k významnému snížení radiotelemetricky měřeného krevního tlaku. Exprese CD36 transgenu byla ve všech studovaných tkáních větší u této linie. Rozdíl v transgenní expresi CD36 byl zvláště výrazný v ledvinách, redukce hypertenze u SHR-TG19 linie tak byla spojena s výrazně zvýšenou renální expresí CD36.

Závěrem lze shrnout, že komplementační analýza pomocí dvou nových transgenních linií s exprimovaným normálním CD36 genem na genetickém pozadí kmene SHR s deleční variantou CD36, prokázala, že defektní CD36 podmiňuje poruchy metabolizmu mastných kyselin, glukózovou intoleranci a inzulinovou rezistenci. Navíc u transgenní linie se zvýšenou renální expresí CD36 byla významně redukována hypertenze. Je tedy možné, že by renální exprese CD36 mohla ovlivňovat regulaci krevního tlaku. Úspěšné vytvoření SHR-TG10 a SHR-TG19 transgenních linií může poskytnout výjímečnou příležitost pro studium mechanizmů, podmiňujících koincidenci rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění (Pravenec a spol, Nature Genetics 27:156-158, 2001).

Distribuce a funkční význam variability v počtu kopií genů V poslední době byla získana řada důkazů pro důležitou úlohu variability v počtu kopií genů (copy number variation - CNV) při regulaci fyziologických a patofyziologických fenotypů. Pomocí počítačových a experimentálních metod byla nalezena variabilita v CNV laboratorního potkana a byly zjištěny důležité funkční vlastnosti podobné CNV u lidí. Navíc bylo nalezeno 113 ortologních CNV u potkana a lidí, z nichž 80 hraje důležitou úlohu v patogenezi lidských onemocnění. Distribuce CNV v genomu je nenáhodná, například na chromozomu 18 se nevyskytují žádné CNV ani jiné duplikace chromozomálních úseků, což je zřejmě způsobeno silnými selekčními mechanizmy odpovědnými za vznik a uchování CNV. Analýzou profilů genové exprese u rekombinantních inbredních kmenů byl odhalen funkční vztah mezi CNV a expresními lokusy kvantitativních znaků. Získané poznatky ukazují, že potkan přestavuje výborný model pro studium fenotypických efektů strukturální variability DNA ve vztahu ke komplexně podmíněným znakům a chorobám u lidí.
(Viz publikace č. 1)

Integrované genomické přístupy odhalily důležitou úlohu osteoglycinu (Ogn) při regulaci hmotnosti levé komory srdeční Hmotnost levé komory srdeční a exprese genů v levé komoře srdeční jsou komplexní znaky regulované vnitřními a vnějšími (systemickými) faktory. K odhalení genetických determinant odpovědných za hmotnost levé komory srdeční jsme využili kombinaci analýzy profilů genové exprese s vazebnými analýzami (tzv. genetická genomika) a s korelačními analýzami mezi hmotností levé komory srdeční a transkriptomem levé komory srdeční u BXH/HXB rekombinantních inbredních (RI) kmenů. S využitím těchto metod a pomocí in vitro funkčních analýz jsme odhalili osteoglycin (Ogn) jako hlavní genetickou determinantu hmotnosti levé komory srdeční u potkana, kdy zvýšená exprese OGN proteinu byla asociovaná s vyšší hmotností levé komory srdeční. Celogenomová analýza transkriptů kvantitativních znaků byla použita i při analýze hypertrofie levé komory srdeční u lidí: z 22,000 transkriptů stanovených v srdeční tkáni získané při operacích pacientů, exprese osteoglycinu vykazovala nejvýznamnější korelaci s hmotností levé komory srdeční. Dále jsme prokázali důležitou úlohu osteoglycinu při in vivo regulaci hmotnosti levé komory srdeční u myší s nefunkčním Ogn genem. Tyto výsledky ukazují, že Ogn je významná genetická determinanta hmotnosti levé komory srdeční u potkanů, myší a lidí tím, že modifikuje hypertrofní odpověď na vnější faktory, jako jsou hypertenze nebo aortická stenóza.
(Viz publikace č. 2)

Genetické mapování pomocí jednonukleotidových polymorfizmů (SNP) a haplotypů Laboratorní potkan patří mezi nejčastěji používané modelové organizmy. Inbrední kmeny laboratorního potkana byly odvozeny z omezené zakládající populace a genetická variabilita poskytuje výborný zdroj pro korelční analýzy mezi genotypy a fenotypy. Byla zjištěna celková genetická variabilita potkana pomocí téměř 3 milionů nově odhalených SNP. U 167 inbredních kmenů potkana, 2 sad rekombinantních inbredních kmenů a F2 interkrosu byly získány přesné a kompletní genotypy pomocí vybrané sady 20,238 SNP a byly vytvořeny podrobné genetické mapy. Tato data charakterizují populační strukturu inbredních kmenů a ilustrují stupeň vazbové nerovnováhy. Tento nový genetický zdroj je veřejně přístupný.
(Viz publikace č. 3)

Odhalení renální exprese Cd36 jako determinanty krevního tlaku a rizikového faktoru vývinu hypertenze Pro odhalení renálně exprimovaných genů, které ovlivňují riziko vývinu hypertenze jsme použili integraci analýzy expresních kvantitativních znaků v ledvině s celogenomovými korelačními analýzami mezi profily genové exprese v ledvině a krevním tlakem u rekombinantních inbredních kmenů odvozených od spontánně hypertenzních potkanů kmene SHR. Tato strategie spolu s transplantacemi SHR, SHR "kongenních" a "Cd36 transgenních" ledvin odhalila deficitní renální expresi Cd36 genu, kódujícího translokázu mastných kyselin, jako geneticky podmíněný rizikový faktor vývinu hypertenze.
(Viz publikace č. 4)

Publikace