Na molekulární úrovni je biologický (fyziologický) výzkum veden k identifikaci a kvantifikaci látek majících biologický (fyziologický) vliv (účinek). Tyto látky mohou být jak nízko, tak i vysokomolekulární. Právě v kategorii vysokomolekulárních látek jsou obecně rozšířené snahy o odhalení strukturálních změn způsobených fyziologickými nebo patofyziologickými podmínkami (stárnutí, nemoc). Tyto strukturální změny se projevují funkčními změnami vysokomolekulárních látek. V této úrovni fyziologického výzkumu můžeme jasně vidět interaktivní vztah mezi analytickou chemií a fyziologií (můžeme použít i termín "analytická fyziologie"). Práce tohoto oddělení je cílena právě ke spojení zmíněných oblastí a může být rozdělena následovně:

1. Rozvoj přístrojové techniky separačních metod.
2. Rozvoj metodik a výzkum nových separačních metod použitelných ke stanovení fyziologicky významných látek (kapilární elektroforéza, HPLC/MS).
3. Změny ve fyziologii strukturálních bílkovin (hlavně pojivové tkáně).

Z úvodu je zřejmé, že všechny tři oblasti jsou navzájem propojeny a není jednoduché je rozdělit do samostatných úkolů. Dobré analytické zázemí oddělení (moderní vybavení, jako je kapilární elektroforéza a HPLC/MS) umožňuje provést analýzy i pro jiná oddělení ústavu. Jako příklad dobré spolupráce lze uvést kooperaci s oddělením epiteliální fyziologie (Funkce epitelu).

S ohledem na oblast přístrojové techniky můžeme zmínit vývoj a konstrukci ultramikroanalytických systémů - čipovou analýzu nebo vývoj off-line kombinace synchronní fluorescenční spektroskopie a kapilární elektroforézy.

Značné úsilí bylo věnováno rozvoji nových metod pro identifikaci a kvantifikaci fyziologicky významných látek. Nejčastěji studovanými látkami byly steroidy. Bylo vyvinuto široké spektrum analytických metod, jako např. kapilární elektroforéza v mikroemulzních a micelárních módech (tzv. elektrokinetická chromatografie) s diode-array detekcí a vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostním spektrometrem (HPLC/MS). Tyto metody nám umožnily detekovat metabolity kortikosteronu a do budoucnosti nám umožňují pohled do metabolismu steroidů u zvířat (savčí a ptačí střevo). Tato práce byla udělána v úzké spolupráci s oddělením epiteliální fyziologie.

Byly rovněž vyvinuty metody pro identifikaci a kvantifikaci širokého spektra dalších látek: vitamíny, pigmenty, dikarbonylové cukry, mastné kyseliny, koenzymy A, aminokyseliny, peptidy a bílkoviny. Pro tyto účely bylo použito hlavně metod kapilární elektroforézy a HPLC/MS. Částečně byly tyto metody vyvinuty ve spolupráci s jinými odděleními ústavu. Jako příklad lze uvést např. identifikaci a kvantifikaci nového pigmentu skořápek ptačích vajec (protoporfyrin IX obsahující zinek). Dalším příkladem může být identifikace vazebného místa Na+/K+-ATPázy pro pyren izothiokyanát. Byly rovněž intenzivně studovány nové separační módy elektromigračních technik - mikroemulzní elektrokinetická chromatografie a bezvodá kapilární elektroforéza.

Zvláštní oblast představuje analýza bílkovin, obzvláště bílkovin pojivové tkáně. Nejpodstatnějšími výsledky jsou:

1. Elektroforetická separace bílkovin a jejich fragmentů v kyselých pufrech za přítomnosti vysoké koncentrace povrchově aktivních látek.
2. Dělení peptidů a bílkovin (kolagenu) v kapilárách naplněných polymerem (polyakrylamid, celulóza nebo polymerní detergent) nebo ve vysoce kyselých pufrech.
3. Elektromigrační separace bílkovin založená na sorpční rovnováze s vnitřním povrchem kapiláry ("open tubular capillary electrochromatography").
4. Identifikace kolagenních fragmentů vznikajících působením tkáňové kolagenázy (metaloproteinázy) při plicní hypoxii.
5. Lokalizace fluoreskující složky v kolagenní molekule, která vzniká při neenzymatické glykaci.

Metody, které byly vyvinuty pro separaci kolagenních fragmentů (kapilární elektroforéza v kyselých pufrech) byly úspěšně aplikovány pro kvantifikaci kolagenních typů I, III a V v tkáních.

Všechny tyto analýzy měly za cíl lépe porozumět fyziologické úloze samovolných (chemických) reakcích mezi volnou amino skupinou (lysin, arginin, N-koncová aminokyselina) pomalu metabolizovaných bílkovin a oxo skupinou endogenních látek (např. aldehydické cukry, peroxidační produkty lipidů). Tyto reakce mají významný vliv jak na normální fyziologické (stárnutí), tak i patofyziologické (diabetes) stavy, tj. na změny biologických funkcí bílkovin. Dalším cílem bylo objasnit úlohu toxických látek schopných modifikovat bílkoviny v životním prostředí, v potravinách a stejně tak odhalit takovéto látky v metabolicky inertních zásobách v tkáních. Souvisejícím aspektem bylo studium kinetiky nízkomolekulárních metabolitů (včetně anorganických iontů) a jejich vazby na složky extracelulární matrice. Pro tyto účely byla vyvinuta metoda umožňující určení vazby olova a zinku na kolagen (nebo jeho fragmenty). Bylo dokázáno, že v kolagenní molekule existují dvě kategorie vazebných míst a jejich počet velmi dobře odpovídá počtu zbytků asparagové a glutamové kyseliny, které jsou k dispozici. Bylo rovněž popsáno, že olovo (po podání ve vodě k pití) je akumulováno v tkáních obsahujících kolagen (placenta a zárodečné obaly).

Krmení laboratorních potkanů vysokotukovou dietou se projeví značným zvýšením koncentrace látek obsahujících reaktivní karbonyl v reperfusátu z jejich srdce (tzn. že se zvyšují reaktivní karbonylové sloučeniny schopné reagovat s bílkovinami přítomnými ve vaskulárních stěně). Koncentrace těchto metabolitů může být opět vrácena na hladinu shodnou s kontrolami, jestliže vyměníme vysokotukovou dietu za standardní peletovanou dietu.

Metabolity vznikající z posttranslačních modifikací (glykace) byly nalezeny ve specifických (dvou) kolagenních fragmentech (odhaleno pomocí kapilární elektroforézy v off-line spojení se synchronní fluorescenční spektroskopií). Glykace a modifikace kolagenu metabolity odvozenými od lipidů byly studovány při stárnutí a u hypertriglyceridických (HTG) potkanů. Bylo zjištěno, že koncentrace pentosidinu (specifická dusíkatá látka vznikající při glykaci a měřená pomocí HPLC) s věkem významně vzrůstá jak v kůži, tak i v ocasních šlachách potkanů. Fluorescence (měřená při čtyřech vlnových délkách typických pro produkty vznikající z cukrů nebo lipidů) významně vzrůstá v závislosti na věku pouze u kožního kolagenu. Významné rozdíly mezi HTG a kontrolními zvířaty byly zjištěny pouze při porovnání obsahu pentosidinu u mladých zvířat, u starých zvířat byly hodnoty stejné. Z těchto výsledků bylo vyvozeno, že bílkoviny s pomalým metabolickým obratem jsou v různých pojivových tkáních rozdílně dostupné k posttranslačním modifikacím a výsledky získané z ocasních šlach (používané jako typický model pojivové tkáně) nemůže být automaticky aplikován na jiné měkké pojivové tkáně v těle.

Byly rovněž studovány posttranslační modifikace bílkovin způsobené podáváním alkoholu. Tento výzkum byl prováděn ve spolupráci s Ústavem soudního lékařství, University ve Veroně, Itálie. Byly sledovány a zjištěny změny ve struktuře (složení) bílkovin vlasů (keratinů) a sérového transferinu, které byly způsobeny alkoholem. Tyto modifikace peptidů transferinu mají soudní (diagnostické) důsledky, které mohou být prakticky použitelné.

Publikace