Obecná charakteristika

Práce oddělení je zaměřena na adhesi, proliferaci a diferenciaci buněk v kulturách a jejich změny vyvolané fyziologickými a lékařsky závažnými patologickými faktory. Předmětem studia jsou především cévní hladké svalové a endotelové buňky a buňky kostní v kulturách na umělých materiálech vyvíjených pro konstrukci náhrad poškozené cévní a kostní tkáně, včetně moderní technologie tkáňového inženýrství, kde umělý materiál slouží jako analog přirozené extracelulární matrix a aktivně reguluje buněčné funkce.

V rámci společné laboratoře (LBNB viz shora) probíhá studium vztahu růstových vlastností nádorových buněk mozku a exprese multifunkčních povrchových molekul skupiny DASH (Dipepdityl peptidase-IV Activity and/or Structure Homologues) a gama glutamyltranspeptidázy.

Metodicky využíváme konvenční i speciální světelně mikroskopické techniky, jako je imunofluorescence, konfokální mikroskopie, substrátová enzymatická histochemie, imunoperoxidázová cytochemie, dále průtokovou cytometrii, enzymatickou imunosorbentní esej (ELISA), vertikální proteinovou elektroforesu a imunoblotting. Další biochemické, molekulárně-genetické a elektron-mikroskopické techniky jsou zajišťovány v externích spolupracích s řadou domácích i zahraničních pracovišť.

Grantové projekty a domácí spolupráce:

Práce oddělení je podporována 10 granty řešenými společně s 1. a 2. lékařskou fakultou UK, Vysokou školou chemicko-technologickou, Ústavem makromolekulární chemie AVČR, Ústavem jaderné fyziky AVČR, Ústavem jaderného výzkumu a. s. v Řeži u Prahy, Ústavem struktury a mechaniky hornin AVČR, Strojní fakultou ČVUT v Praze i s  Ústavem organických syntéz a podnikem Synthesia Pardubice.

Na grantových projektech s námi spolupracují i další průmysloví partneři, jako je Výzkumný ústav pletařský, a.s., Brno (poskytování klinicky užívaných cévních protéz pro inovaci) a firma Beznoska s.r.o. (výroba kovových kostních implantátů a vývoj jejich povrchových modifikací ovlivňujících ukotvení do kosti).

Nově navazujeme i spolupráci s Technickou universitou Liberec, prof. Oldřich Jirsák (nanovlákna pro potenciální využití v inženýrství cévní a kostní tkáně).

Spolupracujeme i s Institutem klinické a experimentální medicíny, Praha, a to zejména na poli inovace klinicky užívaných cévních protéz a cílené dodávky léčiv k cévním buňkám.

Od r. 1999 je Odd. 11 součástí společné laboratoře "Biologie nádorové buňky" vytvořené s 1. Katedrou lékařské chemie 1.LF UK. Někteří členové oddělení jsou integrováni rovněž do Centra výzkumu chorob srdce a cév.

Zahraniční spolupráce:

Laboratoř má i několik zahraničních partnerů, jako je např.

• Dept. of Biomaterials, AGH University of Science and Technology, Faculty of Materials Science and Ceramics, Krakow, Polsko ( vývoj uhlíkových, syntetických polymerních a keramických materiálů, včetně materiálů nanostrukturovaných, pro inženýrství kostní tkáně);

• Université Victor Segalen, l'Unité INSERM 577, Laboratoire de Biophysique, Bordeaux, Francie (inovace současně klinicky užívaných cévních protéz a jejich přestavba na bioarteficiální náhrady s rekonstruovanou tunica intima a media, využití dynamických kultivačních systému simulujících průtok krve cévou);

• Department of Chemistry, Shiga University of Medical Science (SUMS), Seta, Otsu, Shiga, Japan, prof. Naoki Komatsu (uhlíkové nanočástice pro potenciální užití v medicíně a tkáňovém inženýrství);

• Univ. of Pennsylvania, Philadelphia, USA, prof. Dennis Discher (ovlivnění růstu a diferenciace buňky stupněm její adhese ke kultivační podložce, chování buněk v interakci se syntetickými polymery in vitro, cílená dodávka léčiv);

• Centro di Studio per l'Istochimica, C.N.R., Pavia, a University of Pavia, Itálie, prof. Carlo Pellicciari (průtoková cytometrie parametrů buněčného cyklu, adhesních a cytoskeletárních molekul, markerů apoptosy buněk).

1. Inovace současně klinicky užívaných cévních protéz
   
   Jak již bylo předesláno, studujeme možnosti inovace cévních protéz, komerčně vyráběných ve Výzkumném ústavu pletařském, a. s., Brno, z polyetylentereftalátu (PET) pletařskou technologií a užívaných v současné klinické praxi. Vzhledem k relativně vysoké hydrofobii PET se tyto protézy chovají jako bioinertní, tj. neumožňují pokrytí souvislou vrstvou endotelu či rekonstrukci tunica media obsahující hladké svalové buňky. Nanesení fibrinových sítí, které je možné připravit i v autologní podobě z krve pacienta, sice nezvýšilo počet iniciálně adherovaných lidských endotelových buněk získaných z v. saphena (nasazeno 158 000 buněk /cm2), ale zvýšilo výrazně odolnost endotelové vrstvy k odloučení proudem média, simulujícím průtok krve cévou, v dynamickém kultivačním systému (střižné napětí 15 dyn/cm2). Naproti tomu nanesení lamininu na vnitřní povrch protéz zvýšilo počet iniciálně adherovaných buněk, ale nepodpořilo jejich resistenci k namáhání průtokem média. Na obou typech proteinových vrstev bylo však možno již za dva dny po nasazení dosáhnout ve statickém kultivačním systému souvislé vrstvy lidských endotelových buněk. Podobným způsobem se chovaly i hladké svalové buňky z aorty potkana.

   
   

2. Adhese a růst buněk na biomateriálech s ligandy pro adhesní receptory buněk
   
   Byla zahájena i inovace cévních protéz pomocí oligopeptidických ligandů pro adhesní receptory buněk (např. GRGDSG). V předběžných pokusech ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AVČR byly připraveny 2D růstové podložky na bázi polylaktidů a jejich kopolymerů s polyetylenoxidem (PEO) za účelem vytvoření bioinertního povrchu nedovolujícího nekontrolovanou adsorpci proteinů zprostředkujících adhesi buněk z kultivačního média na povrch materiálu. Jako bioinertní povrch se nám nejlépe osvědčil kopolymer polylaktidu (PDLLA) a polyetylenoxidu (PEO) s  molekulovou váhou 11000 a s  koncentrací na povrchu materiálu okolo 33%. Tento extrémně hydrofilní povrch prakticky úplně zabránil adhesi cévních hladkých svalových buněk. Po kovalentním navázání oligopeptidu GRGDSG, tj.ligandu pro buněčné integrinové adhesní receptory, na konce PEO řetězců v 5% nebo 20% koncentraci se adhese buněk obnovila, ovšem za regulovatelných podmínek. Plocha rozprostření buněk, počet, velikost, tvar a distribuce talin- a vinkulin-pozitivních fokálních adhesních plaků, jakož i úroveň následné proliferace a dlouhodobé životaschopnosti buněk závisela na koncentraci sekvence GRGDSG. Nabízí se tak možnost cíleného ovlivnění buněčných funkcí pomocí koncentrace i distribuce adhesních oligopetidů na površích biomateriálů. Chemickým složením adhesních oligopeptidů lze dosáhnout i přednostní adhese určitého buněčného typu k určité části biomateriálu (např. sekvence REDV je preferována endotelovými buňkami, KQAGDV hladkými svalovými buňkami, KRSR osteoblasty atd.)
   

3. Povrchové membránové molekuly a gama glutamyltranspeptidáza v gliomových buňkách
   
   V rámci společné Laboratoře biologie nádorové buňky s 1. lékařskou fakultou UK v Praze jsme zjistili (l) nerovnoměrnou expresi povrchových membránových molekul skupiny DASH (Dipepdityl peptidase-IV Activity and/or Structure Homologs) a gama glutamyltranspeptidázy v gliomových buňkách v kultuře, odvozených ze zvířecích a lidských mozkových nádorů. Zastoupení těchto molekul se mění v závislosti na intensitě proliferace, stupni buněčné diferenciace a metabolické zátěži buněk (deprivace růstových faktorů, cytostatika aj.). Probíhá studium exprese těchto molekul v bioptických vzorcích lidských mozkových nádorů s cílem najít nová diagnostická a prognostická kriteria tohoto onemocnění.
   
   

1. Budeme pokračovat v inovaci současných klinicky užívaných cévních protéz (vyrobených z polyetylentereftalátu či polytetrafluoroetylenu) rekonstrukcí tunica intima, případně media na těchto náhradách. Žádoucí adhese buněk k materiálu bude dosaženo jednak řízeným a definovaným nanášením celých molekul extracelulární matrix, zprostředkujících vazbu buněk jejich adhesními receptory, jednak zavedením přímo oligopeptidických ligandů (RGD, REDV) a jejich kooperujících sekvencí (PHSRN) do materiálu protéz.
   

2. Hodláme vyvinout i vlastní novou bioarteficiální protézu z degradabilních materiálů na bázi polylaktidů, a jejich kopolymerů s polyethylenoxidem, funkcionalizovanou adhesními oligopeptidy pro hladké svalové a endotelové buňky.
   

3. Za účelem inovace a vývoje cévních náhrad budeme zavádět dynamické průtokové a rotační kultivační systémy, umožňující jednak rovnoměrné osazení tubulárních struktur cévními buňkami, jednak expozici buněk na těchto strukturách definovanému průtoku média a dlouhodobému střižnému, tahovému a tlakovému napětí (shear, strain and pressure stress).
   

4. V rámci centra výzkumu chorob srdce a cév a grantového projektu společného s 2. F UK se budeme zabývat ovlivněním adhese, růstu a obsahu diferenciačních markerů v  hladkých svalových buňkách (HSB) cévní stěny kultivací na degradovaných a oxidovaných molekulách extrcelulární matrix (např. na kolagenu modifikovaném mastocyty) a úlohou těchto HSB ve vzniku a rozvoji vaskulárních onemocnění, jako je atheroskerosa a pulmonální i systémová hypertenze.
   

5. Budeme rovněž konstruovat bioarteficiální kostní náhrady na bázi 3D porézních materiálů (např. polymery vyzužené uhlíkovými vlákny či tkaninou, konpozity polymer-keramika apod.), zejména náhrady s hierarchickou mikro- a nanostrukturou odpovídající architektuře přirozené kostní tkáně (např. stěny pórů o průměru řádově stovek mikromerů budou dekorovány keramickými nanočásticemi), což, zejména ve spojení s dynamickým průtokovým či rotačním kultivačním systémem, urychlí vrůstání kostních buněk do materiálu a jejich vyzrávání. U tzv. 2D implantátů budeme hledat vhodné povrchové úpravy buď podporující, nebo omezující jejich pevnou integraci do okolní kostní tkáně.
   

6. Budeme experimentálně vytvářet další biomimetické povrchy a studovat jejich interakci s cévními a kostními buňkami, jako jsou např. povrchy ozářené ionty či UV světlem v různých atmosférách, a celoplošně i přes masky s různou velikostí a tvarem otvorů (tzv. mikrostrukturované povrchy pro využití v tkáňovém inženýrství a dalších biotechnologiích, jako je např.technika „microarrays“). Budeme se věnovat i povrchům nanostrukturovaným (vzniklým např. nanesením uhlíkových nanočástic, jako jsou fullereny, nanotrubičky a nanodiamanty).
   

7. V rámci programu Společné laboratoře (viz shora) budeme pokračovat ve studiu Dipepdityl peptidase-IV Activity and/or Structure Homologů (DASH) a gama glutamyltranspeptidázy v plasmatické membráně a jejich úlohy v regulaci proliferace a invazivního růstového chování v mozkových nádorech.

Publikace