Oddělení neurověd

1. Imortalizovaná linie lidských spinálních prekurzorových buněk vede ke zlepšení motorických funkcí po míšním poranění.

Do akutní míšní léze jsme implantovali neurální spinální progenitorové buňky, či kombinaci buněk a hydrogelů a sledovali jsme vliv implantátů na regeneraci míšní tkáně. Kmenové buňky v časné fázi produkovaly neurotrofické faktory, které zlepšily motorické funkce potkanů a současně pomalu zrály a diferencovaly do neuronů a částečně rekonstruovaly míšní tkáň. Hydrogely překlenuly lézi, podpořily diferenciaci transplantovaných buněk, růst axonů do implantátu a snížily tvorbu gliové jizvy.

Integrace a differenciace spinálních progenitorových buněk v poraněné míše potkana. Dva měsíce po transplantaci byly SPC-01 buňky pozitivní na raný transkripční faktor interneuronů a motoneuronů nkx 6.1. a vykazovaly zvýšenou expresi RNA znaků zralých motoneuronů Islet2 a HB9 (A). Čtyři měsíce po transplantaci byly v transplantátu nalezeny buňky pozitivní na Islet2 a cholin acetyl transferázu (B), zralé markery motoneuronů. (Amemori et al., 2013).

 

Spolupráce: King’s College London, Ústav makromolekulární chemie AV ČR

Publikace: Amemori, T., Romanyuk, N., Jendelová, P., Herynek, V., Turnovcová, K., Procházka, P., Kapcalová, M., Cocks, G., Price, J., Syková, E.: (2013) Human conditionally immortalized neural stem cells improve locomotor function after spinal cord injury in the rat. Stem Cell Res. Ther. 4(3): 68. IF 3,652
Cocks, G., Romanyuk, N., Amemori, T., Jendelová, P., Forostyak, O., Jeffries, A. R., Perfect, L., Thuretm S., Dayanithi, G., Syková, E., Price, J.: (2013) Conditionally immortalized stem cell lines from human spinal cord retain regional identity and generate functional V2a interneurons and motorneurons. Stem Cell Res. Ther. 4(3): 69. IF 3,652
Růžička, J., Romanyuk, N., Hejčl, A., Vetrik, M., Hrubý, M., Cocks, G., Cihlar, J., Přádný, M., Price, J., Syková, E., Jendelová, P.: (2013) Treating spinal cord injury in rats with a combination of human fetal neural stem cells and hydrogels modified with serotonin. Acta Neurobiol. Exp. 73(1): 102-115. IF 1,977.

 

2. Modifikace polymerních hydrogelů na bázi metakrylátu, sloužících k překlenutí léze a jako nosiče pro buněčnou terapii.

Ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AVČR jsme vyvinuli a otestovali polymérní hydrogely na bázi metakrylátu s různými typy pórů a povrchem modifikovaným kladným nábojem nebo peptidickou sekvencí RGD. Hydrogely byly implantovány do akutního modelu míšní hemisekce. Z výsledků vyplynulo, že kladný náboj a síťová struktura pórů s RGD sekvencí na povrchu podporuje růst buněk jak in vitro tak in vivo, a současně i vrůstání axonů a cév hostitele.

 

Metakrylátový hydrogel s modifikovaným povrchem přemostil míšní lézi (A) a podpořil vrůstání axonů (B), cév (C) a astrocytů (D). Sloužil i jakovhodný nosič transplantovaných kmenových buněk (E, F). Měřítko A=400 µm, B,E=100 µm, C,F= 25µm, D=50µm.

 

Spolupráce: Ústav makromolekulární chemie AV ČR

Publikace: Hejčl, A., Růžička, J., Kapcalová, M., Turnovcová, K., Krumbholcová, E., Přádný, M., Michálek, J., Cihlář, J., Jendelová, P., Syková, E.: (2013) Adjusting the chemical and physical properties of hydrogels leads to improved stem cell survival and tissue ingrowth in spinal cord injury reconstruction: a comparative study of 4 methacrylate hydrogels. Stem Cells Dev. 2013 Oct 15;22(20):2794-805. IF 4.670

 

3. Metoda automatického sledování

Ve spolupráci s Univerzitou v Bergenu jsme vyvinuli metodu automatického sledování metastázujících melanomových buněk v mozku. Buňky melanomu byly označeny nanočásticemi na bázi oxidů železa a aplikovány do levé srdeční komory. Zachycené metastázy v mozku byly sledovány a hodnoceny magnetickou rezonancí.

Spolupráce: Univerzita v Bergenu

Publikace: University of Bergen, Norsko Sundstrøm, T., Daphu, I., Wendelbo, I., Hodneland, E., Lundervold, A., Immervoll, H., Skaftnesmo, K. O., Babič, M., Jendelová, P., Syková, E., Lund-Johansen, M., Bjerkvig, R., Thorsen, F.: (2013) Automated tracking of nanoparticle-labeled melanoma cells improves the predictive power of a brain metastasis model. Cancer Res. 73(8): 2445-2456. IF 8.650

Indukované pluripotentní kmenové (iPS) buňky jsou významným zdrojem pro léčbu akutních mozkových příhod

Lidské indukované pluripotentní kmenové (iPS) buňky jsou významným zdrojem pro léčbu akutních mozkových příhod. Neurální prekursory derivované z iPS buněk jsme transplantovali do striata potkanům s modelem iktu. Transplantované buňky diferencovaly do interneuronů a GABAergních neuronů, které vysílaly své axony do substantia nigra. Transplantát rovněž prorostl 5-TH pozitivními buňkami příjemce. Tyto histologické změny vedly k zmírnění funkčního deficitu vyvolaného iktem a ke snížení atrofie substantia nigra, ke které dochází po poškození striato-nigrálních spojů. Transplantované buňky tak mají v léčbě modelu mozkové mrtvice dvojí účinek. V prvních měsících uvolňují látky, které snižují odumírání důležitých struktur v mozku (substantia nigra) a podporují regeneraci nervové tkáně, což se projeví snížením neurologického deficitu způsobeného iktem. V dalších měsících dochází k začleňování diferencovaných buněk do mozkových struktur příjemce a k rekonstrukci příslušných nervových drah.

 

Obr. 1. A. Lidské neurální prekurzory derivované z indukovaných pluripotentních buněk (NP-iPS) transplantované do striata potkana s ischemickou lézí. Šipky lokalizují transplantát. B, C: Lidské buňky (MTC02+) se integrovaly do tkáně hostitele a prorostly gliovými buňkami příjemce (GFAP+). D: Proliferující buňky v transplantátu (Ki67+) nebyly pozitivní na lidský marker MTC02 a jednalo se pravděpodobně o astrocyty nebo mikroglie. E,F,H: Transplantované buňky diferencovaly do DARPP32+ striatálních neuronů a interneuronů (hCalretinin+). G: NP-iPS diferencované do neuroblastů migrovaly ve striatu (DCX+) na krátké vzdálenosti od místa vpichu.

 

Publikace: Polentes J, Jendelova P, Cailleret M, Braun H, Romanyuk N, Tropel P, Brenot M, Itier V, Seminatore C, Baldauf K, Turnovcova K, Jirak D, Teletin M, Côme J, Tournois J, Reymann K, Sykova E, Viville S, Onteniente B.: (2012) Human induced pluripotent stem cells improve stroke outcome and reduce secondary degeneration in the recipient brain. Cell Transplant. 2012;21(12):2587-602, IF 5,13

 

 

Řízené uvolňování gentamicinu z nanovlákenných „sendvičů” s různou tloušťkou vnějších vrstev

 

PharmDr. Šárka Kubínová, Ph.D.
E-mail: sarka.k@biomed.cas.cz | Tel.: +420 241 062 635

 

Technologií bezjehlového elektrostatického zvlákňování byly připraveny nanovlákenné „sendviče” PUR/PVA/PVA s různou tloušťkou vnějších vrstev polyuretanu (PUR) a s inkorporovaným gentamicinem do středové vrstvy polyvinylalkoholu (PVA). HPLC analýza a inhibice bakteriálního růstu potvrdily stabilitu gentamicinu po jeho inkorporaci do nanovláken během procesu zvlákňování. Zvýšení tloušťky vnějších krycích vrstev „sedviče” vedlo k pomalejšímu uvolňování gentamicinu. Nanovlákenné vrstvy s řízeným uvolňováním léčiva představují perspektivní materiál pro použití v různých oblastech medicíny.

 

Obr. 2 A, SEM zobrazení nanovlákenného „sendviče” s vnější vrstvou PUR 4.4 g/m2. B, Graf zobrazující kinetiku uvolňování gentamicinu z nanovlákenných „sendvičů” s různou tloušťkou krycích vrstev.

 

Publikace: Širc, J., Kubinová, Š., Hobzová, R., Stránská, D., Kozlík, P., Bosáková, Z., Mareková, D., Holáň, V., Syková, E., Michálek, J.: (2012) Controlled gentamicin release from multi-layered electrospun nanofibrous structures of various thicknesses. Int. J. Nanomedicine 7: 5315-25, IF 3,130.

 

 

Efektivní cílené magnetické doručování mesenchymálních kmenových buněk do míšního poranění

V buněčné terapii bývá problém doručit dostatečně velké množství buněk na místo poranění. Jednou z možností je využít magnetických nanočástic k cílenému doručení do místa léze pomocí permanentního magnetu. Potkanům s míšní lézí byl implantován nad místo poranění magnet a zvířatům byly intrathekálně aplikovány mesenchymové kmenové buňky značené superparamagnetickými nanočásticemi. Buňky se zkoncentrovaly v okolí léze a jejich distribuce odpovídala vypočítané distribuci magnetických sil působících na transplantované buňky v oblasti léze (obrázek 1). Efektivita cíleného doručování buněk může být ještě zvýšena využitím magnetů, které vytvářejí modulované magnetické pole (obrázek 2). Proto byl navržen matematický model kinetiky cílení buněk do míšní léze a analyzovány parametry magnetického systému kritické pro efektivní cílení buněk.

 

Obr. 3. Hypointensní signál magnetické rezonance z magneticky značených transplantovaných mesenchymových kmenových buněk v oblasti léze u zvířat s magnetickým implantátem A, a bez implantátu D,. Buňky byly u zvířat s magnetem, oproti kontrole bez magnetu, výrazně koncentrované v oblasti léze, barvení na železo berlínskou modří B, E kolokalizuje se zeleným fluorescenčním proteinem C, F. Měřítko = 100 µm.

 

Obr. 4. Magnetické siločáry v okolí plochého A a zubatého magnetu B. Šipky ukazují směr magnetických sil působících na označené buňky. Odpovídající distribuce transplantovaných buněk na povrchu míchy je vyznačená modrými kuličkami. Oblasti s nejvyššími hodnotami magnetických sil jsou označeny zeleně, oranžově a červeně.

 nahoru

 

Laboratoř je zaměřena na studium extracelulárního prostoru (ECP) a zvláště jeho difúzních parametrů. Změny těchto parametrů během různých fyziologických a patologických stavů výrazně ovlivňují mezibuněčnou komunikaci a to především extrasynaptický přenos, ale mají modulační vliv i na přenos synaptický. Změny difúzních parametrů ECP jsou studovány pomocí unikátní iontoforetické metody v reálném čase a difúzně vážené magnetické rezonance v experimentálních modelech, které napodobují patologické stavy a nemoci nervového systému,jako jsou např. nádory, ischemické poškození, změny během stárnutí, poranění mozku a míchy, epilepsie a Alzheimerova choroba. Studie jsou zvláště zaměřeny na výzkum a pochopení mechanizmů udržování iontové a objemové homeostázy, neurogliální interakce a úlohy extracellulární matrix a glie při přenosu signálů. Cílem výzkumu je zlepšení terapeutických a diagnostických metod pro onemocnění CNS a prevence poškození nervového systému.

 

Významné výsledky v roce 2013

 

1. Vliv deficitu alfa-syntrofinu na změny struktury a difúzních vlastností tkáně při zvětšení buněčného objemu během fyziologických a patologických stavů

Transport vody přes aquaporinové kanály zvětšuje a urychluje zvětšení objemu astrocytů především během závažných patologických stavů a během stavů, které jsou spojené se zvýšenou koncentrací draslíka. Změněné difúzní vlastnosti extracelulárního prostoru ovlivňují pohyb neuroaktivních látek nebo trofických faktorů a následně rozsah poškození tkáně nebo distribuci léků. Alfa-syntrofin proto představuje možný cíl pro terapeutický zásah při mozkové ischémii.

 

Obr. Morfologické změny astrocytů v cortexu alfa-syntrofin pozitivních a negativních myší v barvení na GFAP (vlevo), vypočítané změny objemu astrocytů na základě GFAP imunoreaktivity (v středě) a změny objemové frakce extracelulárního prostoru (vpravo) před, během a po aplikaci mírně hypotonického roztoku (H-50, A), silně hypotonického roztoku (H100, B) nebo roztoku se zvýšenou koncentrací draslíku (10 mM K+). Deficit alfa-syntrofinu výrazně snížil sledované změny pouze při aplikaci silně hypotonického roztoku nebo při zvýšené koncentraci draslíku.

 

Spolupráce: 2.LF UK

Publikace: Dmytrenko L, Cicanic M, Anderova M, Vorisek I, Ottersen OP, Sykova E, Vargova L. (2013) The impact of alpha-syntrophin deletion on the changes in tissue structure and extracellular diffusion associated with cell swelling under physiological and pathological conditions. PLoS One. 2013 Jul 5;8(7):e68044., IF 3,73

  

Významné výsledky v roce 2012

 

1. Kvantitativní a kvalitativní změny extracelulární matrix v dysplastické kůře a zhoršení difúzních vlastností tkáně představují další patogenetický faktor, přispívající k neuronální hyperexcitabilitě a vzniku epileptiformní aktivity u lidí

Fokální dysplázie mozkové kůry („focal cortical dysplasia“; FCD) jsou jednou z nejčastějších příčin farmakorezistentní epilepsie u dětí. Naše studie ukázala, že nejenom odchylky v synaptickém přenosu či buněčných funkcích, ale rovněž i odlišné difúzní parametry extracelulárního prostoru, vyvolané změnami ve složení extracelulární matrix (ECM) a astrogliózou, mohou spolupůsobit při vzniku a propagaci epileptiformní aktivity v dysplatické tkáni. Imunohistochemickou analýzu složení ECM v dysplastické a nemalformované kůře jsme provedli ve 163 vzorcích od 62 pacientů, chirurgicky léčených pro refrakterní epilepsii. Výsledky této analýzy jsme porovnávali s hodnotami difúzních parametrů extracelulárního prostoru, t.j. objemovou frakcí α a tortuozitou λ, naměřenými v čerstvě resekované kůře pomocí iontoforetické metody v reálném čase. Ve srovnání s nemalformovanou kůrou jsme u obou typů dysplázie nalezli zvýšenou tortuozitu, která odráží zhoršenou extracelulární difúzi a to i navzdory zvýšené hodnotě extracelulární objemové frakce u FCD typu II. Zhoršení extracelulární difúze korespondovalo se zvýšenou akumulací tenascin R a C a versikanu, zatímco u brevikanu jsme nalezli snižení exprese u FCD typu II. Kvantitativní a kvalitativní odchylky ve složení ECM spolu s doprovodnými změnami difúzních parametrů extracelulárního prostoru mohou ovlivňovat difúzi neuroaktivních látek a tudíž extrasynaptický přenos a podporovat tak hyperexcitabilitu neuronální sítě a vznik epileptických záchvatů. Zhoršení difúzních vlastností tkáně může v neposlední řadě rovněž přispívat i k oslabení účinnosti antiepileptických léčiv.

 

Obr. 1. NeuN imunobarvení ukazuje normální laminární distribuci neuronů u nemalformované kůry. A, a ztrátu laminární a kolumnární organizace neuronů u FCD typu I B; u FCD typu II jsou navíc přítomny velké dysmorfní neurony s atypickou morfologií a aberantní orientací C. Barvení na GFAP ukazuje u nemolformované kůry pouze vzácně se vyskytující GFAP-pozitivní výběžky gliových buněk, převážně v subpiální zóně D. Počet a větvení GFAP-pozitivních výběžků se u FCD typu I zvýšilo E; ještě větší GFAP imunopozitivitu nalezneme u FCD typu II F. Měřítko: A, 500 μm, B a C, 200 μm a E, a F, 100 μm. Tvar difúzních křivek i vypočítané parametry ukazují zvýšenou tortuozitu v obou typech FCD (více u FCD II), t.j. pomalejší extracelulární difúzi, zatímco objem extracelulárního prostoru se významně zvětšil ve srovnání s kontrolní tkání pouze u FCD typu II (pro srovnání šedá silueta reprezentuje křivku ve zdravé tkáni).

 

Obr.2. Imunohistochemická analýza ECM molekul tenascinu R A–C a versikanu D–F v nemalformované kůře, u FCD typu I a FCD typu II. U obou typů dysplázie dochází ke zvýšené akumulaci tenascinu R a versikanu v mezibuněčném prostoru malformované kůry – více u FCD typu II. Měřítko: 50 μm. Výsledky kvantitativní obrazové analýzy imunoreakce proti tenascinu R a versikanu ukazují spodní grafy (signifikantní rozdíly oproti nemalformované kůrě jsou označeny hvězdičkou).

 

Obr. 3. Imunohistochemická analýza ECM molekul tenascinu C A–C a brevikanu D–F v nemalformované kůře, u FCD typu I a FCD typu II ukazuje vyšší extracelulární akumulaci tenascinu C u dysplázie typu II, zatímco pozitivita brevikanu byla u tohoto typu dysplázie snížená. Měřítko: 50 μm. Výsledky kvantitativní obrazové analýzy imunoreakce proti tenascinu C a brevikanu ukazují spodní grafy (signifikantní rozdíly oproti nemalformované kůrě jsou označeny hvězdičkou).

 

Publikace:

Zamecnik J, Homola A, Cicanic M, Kuncova K, Marusic P, Krsek P, Sykova E, Vargova L. (2012) The extracellular matrix and diffusion barriers in focal cortical dysplasias. Eur J Neurosci. 36(1):2017-24. IF 3,658.

 

 

 

Významné výsledky v roce 2011

 

1. U fokální korové dysplázie u lidí je zhoršená extracelulární difúze v důsledku zvýšení množství difúzních bariér, které tvoří změněné astrocytární výběžky a nadprodukce extracelulární matrix

Změny difúzních parametrů extracelulárního prostoru (ECP) jsme sledovali ve vzorcích mozkové tkáně u pacientů chirurgicky léčených na refrakterní epilepsii za použití iontoforetické metody v reálném čase. Vzorky tkáně byly následně histologicky zpracovány pro analýzu přítomnosti a typu fokální korové dysplázie (FCD typ I a typ II), morfologických změn astrocytů a různých molekul extracellulární matrix. V kůre s normální strukturou se hodnoty extracelulární objemové a tortuozity významně nelišily od hodnot, nalezených v kůře experimentálních zvířat. Tortuozita byla signifikantně zvýšena jak u obou typů dysplázie (více u FCD typu II, zatímco objem ECP byl zvýšen pouze u FCD type II. Histologické vyhodnocení ukázalo zvýšení počtu GFAP-pozitivních astrocytárních výběžků u obou typů dysplázie, zvýšenou akumulaci tenascinu C, tenascinu R a versikanu. Z výsledků našich měření vyplývá, že difúze v dysplastické kůře je zpomalena přítomností difúzních bariér v důsledku strukturálních změn neuronů a astrocytů i nadprodukcí a kvalitativními změnami extracelulární matrix. Zhoršená difúze může společně se změnami v expresi receptorů pro neuroaktivní látky a jinými změnami v dysplastické tkáni přispívat k hyperexcitabilitě neuronální sítě a vzniku epileptických záchvatů.

Obr. 2. Histologický obraz zdravé tkáně (kontrola), FCD typu I a II (orig. zvětšení 100x) a odpovídajících difúzních křivek s hodnotami extracelulární objemové frakce a tortuozity. Základní barvení na hematoxylin-eosin (HE) nebo kresyl-violeť (CV u FCD typu I) ukazuje, že typická struktura vrstev zdravé tkáně u obou typů fokálních dysplázií chybí, u FCD II jsou navíc přítomné aberantní balónové buňky (inset, orig. zvětšení 400x). U obou typů dysplázie bylo zvýšené barvení na GFAP pozitivní reaktivní glii; patologická akumulace extracelulární matrix (např. tenascin C) byla detekována pouze u FCD typu II. Tvar difúzních křivek i vypočítané parametry ukazují zvýšenou tortuozitu v obou typech FCD (více u FCD II), t.j. pomalejší extracelulární difúzi, zatímco objem extracelulárního prostoru se významně neliší od kontrolní tkáně (pro srovnání šedá silueta reprezentuje křivku ve zdravé tkáni).

Publikace: Vargova L, Homola A, Cicanic M, Kuncova K, Krsek P, Marusic P, Sykova E, Zamecnik (2011) The diffusion parameters of the extracellular space are altered in focal cortical dysplasias. J.Neurosci Lett. 2011 499(1):19-23.
Zamecnik J, Homola A, Cicanic M, Kuncova K, Marusic P, Krsek P, Sykova E, Vargova L. (in press) The extracellular matrix and diffusion barriers in focal cortical dysplasias. Eur J Neurosci.
 

2. Astrogliální sítě v neurogliální regulaci

Vliv astrocytárních sítí a vzájemnou neurogiální interakci jsme sledovali u zvířat deficitních pro konexiny 30 a 43 (Cx30-/-Cx43-/-). Elektrofyziologické experimenty prokázaly, že propojení a komunikace astrocytů pomocí gap junctions, kterých stavebními jednotkami jsou konexiny, omezuje neuronální aktivitu, pravděpodobnost uvolnění mediátoru a vede k útlumu synaptického přenosu u pyramidových neuronů v CA1 oblasti. U Cx30-/-Cx43-/- myší byla dlouhodobá potenciace (LTP) snížená oproti kontrolám o 80 %, zatímco dlouhodobá deprese (LTD) byla ve srovnání s kontrolami o 100 % zvýšená. Analýza glutamátových a draslíkových proudů po stimulaci Schafferových kolaterál prokázala zvýšenou synaptickou aktivitu, ale sníženou astrocytární funkci pro iontovou a glutamátovou homeostázu u Cx30-/-Cx43-/- zvířat. Relativní pokles objemu extracelulárního prostoru (ECP) u Cx30-/-Cx43-/- myší byl při stimulaci oproti kontrolám dvojnásobný. Menší objem ECP u Cx30-/-Cx43-/- myší potencuje zvýšení extracelulární koncentrace iontů a neuromediátorů a pravděpodobně vede i k akumulaci difúzních bariér, zpomalujících difúzi neuroaktivních látek z místa uvolnění, což zvyšuje ještě více synaptickou aktivitu a prodlužuje neuronální aktivaci.

Spolupráce: Center for Interdisciplinary Research in Biology, INSERM U1050, Collège de France, Paris,France.

Obr. 3. Zvýraznění změn ECP behěm neurální aktivity u Cx30-/-Cx43-/- myší. A: Schéma ilustruje zvýšení extracelulární koncentrace TMA+ iontů během neuronální aktivity v důsledku zvětšení buněčného objemu především gliových buněk. B: Záznam reprezentativních změn [TMA+]e u kontrol a Cx30-/-Cx43-/- myší při stimulaci Schafferových kolaterál (10 Hz/10 s) ve stratum radiatum CA1 oblasti. (C) Vypočítaný relativní pokles objemu ECP ukazuje dvojnásobnou změnu u transgenních zvířat. D a E: Normalizované reprezentativní odpovědi (D) odhalují zvýšení polovičního času návratu („half-decay time“) (E).

Publikace: Pannasch U., Vargová L., Reingruber., Ezana P., Holcman D., Giaume C., Syková E. and Rouach N. (2011). Astroglial networks scale synaptic aktivity and plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(20):8467-72.

  nahoru

je zaměřena na vývoj syntetických biomateriálů pro regeneraci a rekonstrukci tkání a studium jejich funkčnosti na biologických modelech. Ve spolupráci s Fyzikálním ústavem AV ČR se laboratoř zabývá komplexním výzkumem interakcí nízkoteplotního plazmatu s živými organismy a vývojem nových technologií a zařízení pro využití nízkoteplotního plazmatu v biomedicínských aplikacích.

Vývoj biomodifikovaných hydrogelů pro léčbu míšního poškození

Obr. Snímek superporézního PHEMA hydrogelu s orientovanou porositou.

Publikace: Kubinová, Š., Horák, D., Syková, E.: (2009) Cholesterol-modified superporous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) scaffolds for tissue engineering. Biomaterials 30(27): 4601-4609.

Kubinová, Š., Horák, D., Hejčl, A., Plichta, Z., Kotek, J., Syková, E.: (2011) Highly superporous cholesterol-modified poly(2-hydroxyethyl methacrylate) scaffolds for spinal cord injury repair. J. Biomed. Mater. Res. A. 99(4): 618-629.

Kubinová, Š., Horák, D., Hejčl, A., Plichta, Z., Kotek, J.,Proks, V., Forostyak, S., Syková, E.: (2012) SIKVAV-modified highly superporous PHEMA scaffolds with oriented pores for spinal cord injury repair, J. Tissue Eng. Reg. Med., in press.

Vývoj a výzkum nízkoteplotního atmosférického plazmatu pro biomedicínské aplikace

Užitný vzor: Churpita, O., Hubička, Z., Dejneka, A., Jastrabík, L., Zablotskyy, Vitaliy A., Syková, E., Kubinová, Š.: Zařízení pro generaci nízkoteplotního plazmatu s laditelnou koncentrací ionizovaných částic. Device for generation of low-temperature plasma with tunable density of ionized particles. Praha : Úřad průmyslového vlastnictví, 2012. Praha : Fyzikální ústav AV ČR, v.v. i. CZ, Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i., Praha 4, CZ.

Cílené manipulace a doručování kmenových buněk pomocí magnetického pole s vysokým gradientem.

Publikace: Vaněček V., Zablotskii V., Forostyak S., Růžička J., Herynek V., Babič M., Jendelová P., Kubinová Š., Dejneka A, Syková E.: (2012) Highly efficient magnetic targeting of mesenchymal stem cells in spinal cord injury. Int. J. Nanomed. 7: 3719-3730.

1. Vývoj biomodifikovaných PHEMA hydrogelů s orientovanou porozitou pro přemostění léze po míšním poranění

Ve spolupráci s ÚMCH AVČR bylo vyvinuto několik typů biomodifikovaných hydrogelů na bázi poly(2-hydroxyethyl methakrylátu) (PHEMA) pro implantaci do poškozené míchy. Aby bylo možné využít PHEMA scaffold jako nosič kmenových buněk, byly úspěšně zavedeny bioaktivní povrchové modifikace PHEMA hydrogelů pomocí kovalentní imobilizace cholesterolu, peptidové sekvence SIKVAV a fibronektinu. Mechanické vlastnosti a porozita těchto hydrogelů byly optimalizovány tak, aby byla zachována kompatibilita scaffoldu s okolní tkání a současně aby bylo umožněno funkční přemostění léze. Vybrané hydrogely s orientovanou porozitou a povrchovou modifikací SIKVAV byly dále hodnoceny v kombinaci s kmenovými buňkami in vivo po implantaci do míšní hemisekce. Orientovaná porozita hydrogelů stimulovala vrůstání axonů a dalších tkáňových struktur do implantátu, nicméně pro funkční přemostění míšního poškození je nutné zapojit další terapeutické přístupy (růstovné faktory, rehabilitace, aj.).

Spolupráce: Ústav makromolekulární chemie AV ČR

2. Vývoj biologických scaffoldů z decelularizované matrix 

Obr. (A) Fibroblasty kultivované na hydrogelu připraveném z decelularizované matrix. (B) Podélný řez míchy potkana s hydrogelem implantovaným do míšní léze. (C) Vrůstání neuronálních výběžků a (D) cév do implantovaného hydrogelu. Měřítko: (A) 50µm, (B) 500 µm, (C, D) 100 µm.

Spolupráce: McGowan Institute for Regenerative medicine, Pittsburgh 

Publikace: Kubinová, Š., Horák, D., Hejčl, A., Plichta, Z., Kotek, J., Proks, V., Forostyak, S., Syková, E. SIKVAV-modified highly superporous PHEMA scaffolds with oriented pores for spinal cord injury repair. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2013 Feb 11. doi: 10.1002/term.1694., in press. IF 2.826

Užitný vzor: 2013-28192: Atmosférický zdroj plazmatu, zejména pro využití v medicínských bioaplikacích, Fyzikální ústav AV ČR, v.v.i., Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.
 

 nahoru

1. Nový regenerační faktor (RGTA, CACICOL20) pro hojení chronických rohovkových poranění a onemocnění

Prokázali jsme, že nový regenerační faktor (RGTA, CACIC0L20) je účinným prostředkem pro hojení rohovkových poranění, především špatně se hojících chronických vředů. Po aplikaci RGTA se exprese proteolytických enzymů (zejména metaloproteináz) a enzymů generujících oxid dusnatý v chronických ranách podstatně snížila, což bylo doprovázeno hojením rohovky bez výrazného zjizvení. Neovaskularizace rohovky a intraokulární zánět ustoupily. Rohovková průhlednost se obnovila zcela, anebo částečně.

Reprezentativní fotografie králičí rohovky s vředy, které se vyvinuly po poleptání rohovek 1.0 N Na0H a následně léčeny pomocí RGTA, anebo placebem. a - Kontrolní oko. Rohovka prvního oka jeden den po alkalickém poškození louhem sodným. Rohovková průhlednost je ztracena; b – Rohovka prvního oka jeden měsíc po poleptání (rohovka byla neléčena). Vyvinul se středový rohovkový vřed (šipka); d – Rohovka stejného oka po následném měsíčním léčením kapáním RGTA. Rohovkový vřed je zhojen (šipka); e - Rohovka druhého oka jeden den po poleptání louhem sodným. Rohovková transparence je ztracena; f - Stejná rohovka po jednom měsíci (rohovka bez léčení). Vytváří se středový rohovkový vřed (šipka); g - Stejná rohovka po dalším měsíci, kdy byla léčena placebem. Vřed je vyvinutý v celé tloučtce rohovky (šipka) a přetrvává. Rohovka je vaskularizovaná.

Exprese genů prozánětlivých cytokinů v rohovce poleptané louhem sodným a léčené RGTA anebo placebem. V rohovkách poleptaných louhem a léčených placebem, nebo RGTA byly stanoveny po 7 dnech (po 0.15 N NaOH) a po 21 dnech (po 1.0 N NaOH) exprese genů pro IL-1β (a), IFN-γ (b) a i-NOS (c) pomocí real-time PCR. Každý sloupcový graf představuje +- SD alespoň ze třech stanovení. Signifikantní rozdíly : *P<0.05, ***P<0.01 mezi rohovkami léčenými RGTA a placebem.

 

Spolupráce: Thea Laboratoires, Clermont Ferrand, France (Dr.Celine Olmiere), Oddělení transplantační imunologie (prof. RNDr Vladimír Holáň, DrSc.)

Publikace: Cejkova J, Olmiere C, Cejka C, Trosan P, Holan V (2013). The healing of alkali-injured cornea is stimulated by a novel matrix regenerating agent (RGTA, CACICOL20): a biopolymer mimicking heparan sulfates reducing proteolytic, oxidative and nitrosative damage. Histol Histopathol 2013 Oct 9. (29,457-78,2014).IF 2,281.

 

2. Králičí kmenové mesenchymové buňky na nanovláknových nosičích hojí oxidační poškození rohovky, vyvolané louhem sodným

Králičí mesenchymové kmenové buňky na nanovláknových nosičích přeneseny na povrch poškozeného oka zhojily oxidační poškození, vyvolané alkalickým poraněním. Alkalické poranění oka vyvolá prooxidační/antioxidační nerovnováhu, vedoucí v rohovce ke zvýšenému množství prozánětlivých cytokinů a k tvorbě peroxynitritu a malondialdehydu. Mesenchymové kmenové buňky signifikantně redukovaly oxidační poškození rohovky a zhojily rohovku s navrácením průhlednosti.

Reprezentativní fotografie rohovek, poleptaných louhem sodným (0.15 N NaOH) (A-G), rohovková neovaskularizace (H) a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) (I) 15. den po poranění. A - zdravé, kontrolní oko; B - okamžitě po poškození louhem je rohovka zašedlá; C - poraněná rohovka, na kterou byly přeneseny mesenchymální kmenové buňky na nanovláknitých nosičích a přišity ke spojivce; D, E - V neléčené rohovce se vyvinula vysoká neovaskularizace (stupeň 4) (D), nebo středně mohutná neovaskularizace (stupeň 3) (E). Naopak, v rohovce poškozené a léčené pomocí MSCs se vyvinula slabá neovaskularizace (stupeň 2) (F), anebo byly v rohovce shledány pouze ojedinělé cévy (stupeň 1) (G). H - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace počítáním cév. I - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace pomocí real-time PCR (exprese genů pro VEGF).

Barvení Haematoxylin-eosinem (HE) (a,b), exprese vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF) (c-f) a makrofágů (g-j) 15. den po poškození rohovky louhem sodným (0.15 N NaOH). a – V neléčené rohovce jsou ve vaskularizovaném stromatu (šipky) četné zánětlivé buňky; b – V rohovce léčené MSCs je počet zánětlivých buněk redukován. Cévy nejsou přítomny; c, e – V poškozené neléčené rohovce je exprese VEGF silně vyjádřena , zatím co v rohovce poškozené, ale léčené MSCs, je exprese VEGF nízká (d). V kontrolní rohovce není exprese přítomna kromě slabé exprese v epitelu (f). V poškozené neléčené rohovce je velké množství makrofágů (g, i), zatím co v rohovce poškozené a léčené MSCs jsou v rohovkovém stromatu pouze ojedinělé makrofágy. j – rohovka kontrolní, bez makrofágů.

1. Nebezpečí dlouhodobého pobytu na slunci pro lidské oko

Solární UVB záření vyvolá v rohovce intrakorneální zánět, zvýšenou rohovkovou hydrataci a změnu transmise světla rohovkou. Tyto změny jsou doprovázeny mlhavým viděním, změnou ostrosti vidění. V pokusech na králičí rohovce a porovnáním dávek záření experimentálních s dávkami UVB záření udávanými v literatuře, dopadajícími na lidskou rohovku ze slunečního světla jsme prokázali, že celodenní pobyt na slunci po čtyři po sobě jdoucí dny je pro člověka nebezpečný a může vyvolat trvalé změny v optických vlastnostech oka.

Obr. Grafy (Obr. 1. a Obr. 2.) vyjadřují průměrná absorpční spektra králičí rohovky, vyjádřená jako průběhy transmitance resp. absorbance po 4 dnech ozařování rohovky při denní dávce 0.5 J/cm2 nebo 1.0 J/cm2 a po dvou měsících hojení rohovky v porovnání k průměrným hodnotám absorpčních spekter normální rohovky (spektra jsou relevantní nad 300 nm). Z průběhu spekter vyplývá, že po opakované vyšší dávce UVB záření se průchod světla rohovkou neobnoví k původním hodnotám. Dávky 0.5 J/cm2 a 1.0 J/cm2 odpovídají u člověka pobytu na slunci a přímé expozici oka (rohovky) UVB záření po dobu 5 a 10 hodin.

2. Metoda impresních cytologií epiteliálních buněk rohovky jako citlivá diagnostická metoda

Porovnáváním vhodných imunohistochemických márkrů v kryostatových řezech králičí rohovky se stejnými márkry detekovanými na impresních rohovkových cytologiích na Millicelových membránách jsme zjistili, že impresní cytologie jsou velmi citlivou metodou pro diagnostiku rohovkových poranění anebo onemocnění. Prokázali jsme to na experimentálním poškození rohovky UVB zařením, kde trehaloza účinně zrychlila hojení rohovky a snížila rohovkovou neovaskularizaci. Metoda je využitelná v humánní medicině. Podává obraz rohovkového poškození, aniž by pacienta zatížila náročným vyšetřením.

Porovnání imunohistochemické detekce plasminogen aktivátoru urokinázového typu (u-PA) v kryostatových řezech králičí rohovky s detekcí u-PA v impresních cytologiích buněk rohovkového epitelu Obr. Imunohistochemické detekci plasminogen aktivátoru urokinázového typu (u-PA) v kryostatových řezech rohovkového epitelu (a, c, e, g, i, k, m) odpovídá detekce u-PA na impresních cytologiích buněk rohovkového epitelu (b, d, f, h, j, l, n). Na obrázku je to ukázáno u rohovky ozářené UVB zářením a lokálně léčené trehalozou. Ozáření rohovky UVB paprsky vyvolá vysokou expresi U-PA (a, b) v porovnání k normální rohovce (k, l), kde barvení u-PA je velmi nízké. Trehaloza, disacharid glukozy, snižuje expresi u-PA (e, f – po jednom týdnu aplikace trehalozy na oko, i, j – po dvou týdnech aplikace) v porovnání s aplikací fyziologického roztoku na rohovku, kde exprese u-PA je podstatně vyšší (c, d – po jednom týdnu aplikace, g, h – po dvou týdnech aplikace na oko). Na obrázku m, n je negativní kontrola (inkubační roztok bez primární protilátky). Pouze jádra se barví dobarvením (haematoxylinem).

Centrální tlouštka rohovky jako index rohovkové hydratace

Měření rohovkové hydratace podle centrální tlouštky rohovky je citlivým márkrem jejího poškození, které lze využít pro rychlé zjištění rohovkového poranění anebo onemocnění i např. účinnosti ochranných očních UV filtrů.

Změny centrální tlouštky rohovky měřené ultrazvukovým pachymetrem před jejím ozářením UVB paprsky (312 nm dávka 0.25 J/cm2) první den a v dalších dnech při stejné denní dávce. V průběhu ozařování byl na oko aplikován (kapáním) UV filtr, actinoquinol v kombinaci s kyselinou hyaluronovou, anebo fyziologický roztok. Diference mezi středovými tlouštkami rohovky (hydratací) mezi oběma případy byly signifikantní. Králičí oko bylo chráněno UV filtrem před škodlivým účinkem UVB záření při denní dávce 0.25 J/cm2 čtyři po sobě jdoucí dny, což přibližně odpovídá expozici lidské rohovky UVB paprskům ze slunečního záření po dobu 2.5 hod. denně v průběhu čtyř po sobě jdoucích dnů.

Obr. 6. Poškození jednotlivých vrstev rohovky vyvolá změny její hydratace, které se projeví změnou centrální tloušťky rohovky, kterou lze měřit pomocí ultrazvukového pachymetru. Posuzování poškození rohovky dle změn její tloušťky je způsob velmi citlivý a využitelný k rychlé orientaci rohovkového poranění anebo onemocnění, jak jsme prokázali kombinací metod biochemických a imunohistochemických. Tento způsob lze využít i ke zjištění účinnosti ochranných očních UV filtrů.

Citace výstupu: 16
Spolupracující subjekt: Dr. Luyckx, Ph.D., Laboratoires Thea, Clermont-Ferrand, France.
Kontaktní osoba: Ing. Čestmír Čejka, Ph.D., 241062208, e-mail: cestmir.cejka@seznam.cz

Publikace: Cestmir Cejka, Jacques Luyckx, Jitka Cejkova: Central corneal thickness considered an index of corneal hydration of the UVB irradiated rabbit cornea as influenced by UVB absorber. Physiol Res (2012) 61, 299-306. IF 1.55

 nahoru