|
|
Close Help | ||||||||||||||
(společné servisní pracoviště pro zaměstnance BC AV ČR, v. v. i., a PřF JU)
Branišovská 31, 370 05 České Budějovice
| A) |
sekvenační reakce (po domluvě můžeme dodat i primery T7f, T7r, M13f, M13r, SP6r)
+ čištění produktů pomocí BDXT + ELFO |
129 Kč vč. DPH |
|---|---|---|
| B) | čištění produktů pomocí BDXT + ELFO |
110 Kč vč. DPH |
| C) | ELFO (sekvenační reakce, fragmentační analýza) | 80 Kč vč. DPH |
Pro pracovníky HBÚ se na základě dohody s ředitelem HBÚ všechny ceny zvyšují o 80,- Kč v položce servisní náklady, protože HBÚ se nepodílí na činnosti LG. Stejné navýšení se týká i externích uživatelů.
Pro zaměstnance BC AV ČR, v. v. i., se uvedená cena bez DPH přeúčtovává na vrub nákladového střediska a úkolu žadatele.
Pro zaměstnance PřF JU je uvedená cena stanovena včetně DPH a včetně DPH se fakturuje PřF JU.
| 2003 | ELFO |
|---|---|
| 2004 – 2005 | ELFO + čistění vzorků na Sephadexu |
| 2006 | ELFO + kompletní sekvenační reakce, fragmentační analýza |
| 2007 | kompletní servis využívá více než 95 % zákazníků |
Vzorky na čištění prosíme nahlásit do 10:00 h a přinést do 13:00 h.
Sekvenaci provádíme na přístroji ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems
Analýza je založena na Sangerově metodě:
Sanger, F.S., Nicklen, S. and Coulson, A.E. (1977) DNA sequencing with chain-termination inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467.
Templát v množství dle tabulky + 2,5 pmol primeru + voda - celkový objem 7,5 µl - vše v 200 µl eppendorfkách
| Templát | Množství |
|---|---|
| Kit 3.1 | |
| PCR produkty: | |
| 100-200 bp | 0,5-1,5 ng |
| 200-500 bp | 1,5-5 ng |
| 500-1000 bp | 2,5-10 ng |
| 1000-2000 bp | 5-20 ng |
| >2000 bp | 10-25 ng |
| ssDNA | 12,5-25 ng |
| dsDNA | 75-150 ng |
V případě, že budete požadovat, abychom primer přidali sami, prosíme abyste nám v 200 µl eppendorfkách dodali templát + vodu o celkovém objemu 7 µl. Svůj požadavek nezapomeňte specifikovat v přiloženém formuláři.
Máme tyto primery: T7f, T7r, M13f, M13r, a SP6r.
Doporučujeme, abyste využívali výše uvedený plný servis. Přinesete-li nám vzorky již po reakci, doporučujeme dělat osminovou reakci s výslednými 10 µl produktů. Jinak totiž proděláte, nové čistění je samo o sobě dražší (čistění+ELFO 110 Kč) a s osminovou reakcí počítá. V případě, že přinesete již vyčistěné produkty bude třeba čekat na 16 vzorků , neboť máme 16 kapilárový systém a tyto vzorky musíme zpracovávat v jiném režimu.
Nutná osobní konzultace.
Formulář pro kompletní servis s provedením sekvenační reakce 
V případě, že požadujete pouze elfo, případně s přečištěním pomocí BDXT, nepožadujeme žádný formulář.
Na www.appliedbiosystems.com/sequencescanner je k volnému stažení SEQUENCE SCANNER SOFTWARE v 1.0. Je lepší než Chromas, zobrazuje analyzovaná i raw data a umožňuje současně srovnávat až 4 analýzy. Je to jenom prohlížeč, ale i tak má své přednosti. Ukazuje veškeré parametry analýzy včetně informací o proudu, napětí, teplotě atd.
Co je též velmi příjemné, ukazuje nejen píky a AGCT, ale i spolehlivost určení báze. V případě, že je toto určení jisté, objevuje se modrý proužek, jehož délka klesá s jistotou stanovení. U méně jistého určení pak barva proužku přechází přes žlutou na červenou a teprve pak se objeví N. Máte tedy perfektní informaci o tom, na čem můžete stavět a co až tak spolehlivé není.
Software je určen pro ABI analyzátory. Komprimovaný soubor má přes 60 MB a pokud Vám nepůjde stáhnout, můžeme Vám ho vypálit na CD.
interpretace sekvenačních dat (obrázek)
Přikláníme se k horním hodnotám v doporučovaném rozsahu množství DNA. Obecně si nemůžeme dovolit doporučovat ještě vyšší hodnoty, protože chybou je nejen málo, ale i příliš mnoho templátu. Přezářený detektor pak špatně určuje vrcholy píku a nevidí píky malé. V případě, že vzorek obsahuje inhibitory (poměrně častý případ), je zvyšování množství templátu rovněž kontraproduktivní.
Při stanovení koncentrace DNA je často pohled zkušeného oka na gel dostatečný. Fotometrie jako metoda, původně navržená pro měření znečistění proteinů DNA, není příliš vhodná. Navíc stávající přístroje na ústavech jsou málo citlivé, málo stabilní a reprodukovatelné a nevyhovující i mechanicky. Další komplikaci přináší ředění vzorků: vzorky jsou často ředěny až 100x. Zejména u PCR produktů se potom blížíme hranici šumu, který je pak 100x vynásoben. Je třeba vždy vzhledem k obsahu DNA zvážit, zda po naředění bude vzorek ještě měřitelný. Doporučujeme zapsat si naměřenou absorbanci, aby bylo možno zpětně posoudit měřitelnost vzorku. U PCR produktů se nám osvědčilo vzorky neměřit a do reakce dát maximum.
Nebudete-li si jisti, že měříte správně, příjďte, změříme vzorky fluorimetricky.
Správně navržený primer a správná teplota nasedání jsou důležité. Je doporučováno dávat 2,5 pmol na reakci (přestože se říká, že přebytek neškodí, nedoporučujeme víc než 4 pmol). Dimerizace primeru je sice věc konstrukce primeru, ale příliš velké přebytky primeru určitě nemohou prospět.
Podstatná je i její čerstvost: výluh stěn není prospěšný.
Používáme nejen standardních 50 stupňů, ale všechny vámi požadované teploty. Expertem na vztah Tm a Ta je Mgr. Tomáš Chrudimský, tomas.chrudimsky@gmail.com
Snadno rozeznatelné v raw datech, způsobují charakteristický prudký pokles výšky píků. Zvýšení množství templátu v takovém případě nepomůže, naopak uškodí. Jako inhibitory působí tyto látky: hemoglobin, heparin, polyfenol, polysacharidy, chloroform, fenol, EDTA, SDS, xylol, etanol, bromfenol blue a SYBR green.
Je třeba, aby templát byl přečistěn na kolonkách Quiagen nebo eluován z gelu roztoky o nízké iontové síle. Inhibičně působí i 40 mM roztok NaCl, což je 4x zředěný fyziologický roztok.
Při narušení kterékoliv z výše uvedených podmínek reakce neproběhne kvantitativně. Zbylé terminátory pak vytvářejí agregáty, tvořící 4 velké píky charakteristických tvarů a polohy. Ty ztěžují (i když ne úplně vylučují) čtení, neboť se neobjevují na začátku procesu, ale zasahují do čtené oblasti. Různé množství vypadlých terminátorů pak způsobuje odchylky v morfologii píků. Tyto rušivé píky jsou bohužel poměrně časté, což svědčí o tom, že podmínky reakce nejsou v mnoha případech dodrženy. Zmíněné píky lépe než přesrážení redukuje čistění na Sephadexu (provádíme), ale ani to nezaručuje 100 % úspěšnost.
 |
Biologické centrum Akademie věd České republiky, v. v. i. |
