Současná aktivita Izotopové laboratoře vychází z více než 50-ti leté praxe jejích pracovníků s radiochemickými technikami. Během tohoto období byly pro různé ústavy Akademie věd a jiná výzkumná pracoviště připraveny značené sloučeniny různých typů, např. aminokyseliny a peptidy, cukry, mykotoxiny a fytohormony. Připravené sloučeniny byly užity v oblastech biologického a lékařského výzkumu, jako je výzkum a šlechtění rostlin, metabolické studie nových léčiv, radioimunoanalytické techniky a další.
V současné době je práce Izotopové laboratoře zaměřena na syntézu prekursorů pro značení organických sloučenin, přípravu sloučenin značených izotopy vodíku a uhlíkem-14, syntézu neznačených purinových a pyrimidinových derivátů, aplikaci radioanalytických metod v biologickém a environmentálním výzkumu a studium fytoekdysteroidů, fytosterolů a přírodních analogů hmyzích juvenilních hormonů (např. juvabion), které rostliny biosyntetizují a využívají jako obrany zejména proti herbivornímu hmyzu.
Výsledky těchto aktivit jsou využívány nejen výzkumnými týmy Ústavu experimentální botaniky, ale i dalšími akademickými, universitními i resortními výzkumnými pracovišti. Připravené radioaktivně značené látky jsou rovněž poskytovány ústavům a výzkumným laboratořím z celého světa, pracujícím v oblastech rostlinné fyziologie, zemědělského a biomedicínského výzkumu.
Syntéza tritiem značených cytokininů o vysoké molové radioaktivitě
Přírodní cytokininy představují skupinu adeninových sloučenin, modifikovaných v poloze N6. Pro široké spektrum biologických účinků jsou v centru ústavních výzkumných aktivit. V návaznosti na tento výzkum a pro jeho podporu jsou v Izotopové laboratoři připravovány cytokininy značené izotopy vodíku (deuteriem a tritiem). Tritiem značené isoprenoidní cytokininy (jako např. zeatin, dihydrozeatin, N6-isopentenyladenin a jejich ribosidy) i aromatické cytokininy (např. N6-benzyladenin, N6-(3-hydroxybenzyl)adenin a jejich ribosidy) jsou připravovány např. katalytickou hydrogenací nebo dehalogenací beznosičovým tritiovým plynem. Surový radioaktivní produkt po vyčištění pomocí HPLC poskytne cytokinin o velmi vysoké molové radioaktivitě (>1TBq/mmol) a vysoké radiochemické čistotě. Podobně byly připraveny některé deuteriem značené cytokininy jako standardy pro hmotnostní spektrometrii. Mnoho pozornosti je věnováno i přípravě unikátních prekursorů (s násobnou vazbou nebo halogenovaných), ze kterých jsou poté připravovány tritiem selektivně značené cytokininy.
Syntéza sloučenin, odvozených od rostlinných hormonů, s inhibičním efektem na cyklin-dependentní kinázy
Objevení specifického inhibitoru cyklin-dependentních kináz pojmenovaného olomoucin vedl k hledání účinějších derivátů. Toto úsilí vedlo k objevení účinějšího inhibitoru cyklin-dependentních kináz, pojmenovaného roscovitin, který je v současnosti ve 2. fázi klinického výzkumu v Anglii (naše spolupráce s Cyclacell) jako cytostatikum. Náš současný projekt je zaměřen na přípravu nové generace selektivních inhibitorů jednotlivých cyklin-dependentních kináz (CDK2, 4, 5) a na studium vztahu mezi strukturou a aktivitou v různých kinázových testech. Chemie těchto derivátů je odvozena od chemie purinů, jejich aza- nebo deaza- analogů a chemie pyrazolo-[4,3-d]pyrimidinů. Nové deriváty jsou připravovány metodami klasické organické syntézy. Sloučeniny s vyšší inhibiční aktivitou jsou rovněž připravovány značené tritiem pro farmakokinetické studie.
Aplikace radioanalytických metod v biologickém a environmentálním výzkumu
Za užití radioanalytických metod, uhlíku 14 a chloru 36 je studována úloha chloru v lesním ekosystému. Zvláštní pozornost byla zprvu věnována fytotoxické kyselině trichloroctové (TCA) v systému smrk ztepilý/půda, její biodegradaci a dále přírodní tvorbě chloroctových kyselin (CAAs) v lesní půdě, zejména enzymatickou chlorací půdní organické hmoty (SOM).
Byl zkoumán příjem, translokace a osud TCA v řízkovancích smrku včetně distribuce a dlouhodobého chování po příjmu kořeny. U čerstvého jehličí je příjem intensivnější než u staršího a je dán transpiračním proudem. TCA v jehličí není stálá, 16 měsíců po aplikaci na začátku růstové sezony obsah poklesl až na 1–2% počátečních hodnot. TCA je v jehličí degradována mikrobiálně na chlorid a CO2, menší část TCA je dekarboxylována. Vzniklý oxid uhličitý je zčásti reasimilován. Bylo ukázáno, že v chloroplastech jehličí smrku absorbovaný perchlorethylen (atmosférický polutant antropogenního i přírodního původu) je oxidován na TCA, která tam působí mnohem zhoubněji než TCA přijatá kořeny. V lesní půdě je TCA degradována především mikrobiálně, rychlost degradace je závislá na obsahu humusu (Corg), vlhkosti a teplotě. V organickém fermentačním horizontu je TCA stálejší než v horizontu hlubším, anorganickém. K abiotické degradaci TCA v půdě na oxalát dochází v zanedbatelné míře. Studie chlorace půdní organické hmoty v lesní půdě pomocí 36Cl jako součást tématu „Chlor v lesním ekosystému“ ukázala, že v přítomnosti chloroperoxidázy (CPO) jsou huminové kyseliny (HA) chlorovány mj. na dichloroctovou kyselinu (DCA) a TCA, zřejmě radikály chloru tvořenými v půdě jak enzymaticky tak také Fentonovou reakcí. Za přirozených podmínek dochází také v lesní půdě ke tvorbě TCA, DCA a rovněž chloroformu, jehož vznik byl prokázán. Tato zjištění dokládají enzymatickou chloraci, tvorbu CAAs, chloroformu a dále chlorovaných huminových kyselin v půdě. Tato chlorace zřejmě představuje jednu cestu degradace SOM, v níž CAAs hrají roli intermediátů. Nutným předpokladem zamezení ztrát TCA biodegradací především během extrakce TCA z půdy vodou je zmražení půdních vzorků po odběru a jejich volné rozmrznutí při analýze. Pro stanovení [1,2-14C]TCA byla vyvinuta nová metoda založená na termické dekarboxylaci TCA na chloroform a CO2, měřena je radioaktivita extrahovaného chloroformu. Pro stanovení chloroformu vznikajícího v přírodě chlorací SOM byla vypracována ECD-GC metoda kombinovaná s SPME technikou. Byl ukázán negativní vliv zimního solení komunikací na přilehlé lesní porosty (půdu, půdní roztok, spodní vodu i vegetaci).
Supramolekulární materiály na bázi přírodních fytosterolů pro využití v biologii a medicíně
Základem tohoto programu je v současné době projekt 2B06024 (Supramolekulární materiály na bázi přírodních fytosterolů pro využití v biologii – SUPRAFYT), který řeší sdružení několika významných institucí spolu s průmyslem. Projekt je součástí Národního programu výzkumu II (NPV II) vyhlášeného a finančně podporovaného zadavatelem, Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy.
Doba řešení projektu: 01/07/2006 – 30/06/2011
Řešitelské subjekty:
Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i. (www.ueb.cas.cz ; Doc. Ing. Zdeněk Wimmer, DrSc., koordinátor projektu)
Ústav chemických procesů AV ČR, v.v.i. (www.icpf.cas.cz ; Ing. Helena Sovová, CSc.)
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze (www.vscht.cz ; Prof. RNDr. Pavel Drašar, DrSc.)
Chemispol, spol. s r. o. (Ing. Antonín Čapek)
V současnosti je jeden z výzkumných projektů řešen ve spolupráci s EHPNorsko
Definice účelu projektu:
Pro zajištění zdravého a kvalitního života (tématická oblast 1.5 programu NPV II) současných a budoucích generací lidí na této planetě je zapotřebí zavést a respektovat velké množství ochranných opatření. Nejdůležitějším opatřením je bezesporu zajištění nezávadné výživy lidstva a zabezpečení snadné dostupnosti kvalitní pitné vody. Tyto požadavky se jednoznačně promítají do oblastí, které mohou zdroje potravin a pitné vody znečišťovat. Jednou z takových oblastí je vlastní produkce hospodářských plodin, sloužících jako vstupní suroviny pro výrobu základních potravin. Významným konkurentem člověka při velkoprodukci hospodářských plodin je hmyz, který dokáže zničit či znehodnotit až několik desítek procent zemědělské produkce. Použití toxických látek pro hubení hmyzích škůdců je nadále nepřípustné jak z hlediska produkce nezávadných potravinových vstupů, tak z hlediska ochrany spodních vod omezením či zákazem používání toxických sloučenin, které mohou být metabolizovány na stejně či i více toxické sloučeniny. Alternativu nabízí použití látek, které selektivně ovlivňují vývoj a rozmnožování hmyzu, způsobují morfologické změny v jeho vývoji a jsou prakticky netoxické k ostatním živočichům. Inspiraci pro takovýto způsob regulace hmyzích škůdců je třeba hledat opět v přírodě samotné.
Rostliny přežívají napadení a poškození ze strany organismů a v důsledku environmentálního stresu po tisíciletí. Vybudovaly si různé mechanismy obrany, jako vytvoření fyzických bariér, či obranu založenou na biosyntéze obranných sloučenin. Mezi takové látky patří rovněž fytoekdysteroidy a jejich prekursory, fytosteroly, a přírodní analogy hmyzích juvenilních hormonů (např. juvabion), které rostliny biosyntetizují a využívají za účelem obrany zejména proti herbivornímu hmyzu. Oba typy těchto sloučenin působí morfologické změny ve vývoji hmyzu, v jejichž důsledku hmyz není schopen normálního vývoje, či rozmnožování. Účinek těchto sloučenin se též může projevovat redukcí hmotnosti hmyzu, poruchami svlékání v procesu vývoje, či zvýšenou mortalitou v důsledku uměle vyvolaného hladovění.
Běžnými metodami isolace nových látek byla vždy jejich extrakce do vhodného rozpouštědla či směsi rozpouštědel, odstranění rozpouštědla obvykle některým z destilačních postupů a následné chromatografické rozdělení extraktu na jednotlivé frakce a čisté látky. Poté následuje identifikace takových přírodních produktů a jejich další výzkum. Takové metody jsou náročné zejména pokud jde o množství použitých rozpouštědel a navíc za podmínek extrakcí (vyšší teplota či dlouhodobé zahřívání k bodu varu použitého rozpouštědla) dochází k částečné degradaci biologicky či farmaceuticky významných přírodních látek. V poslední době se nabízí alternativní způsob isolace přírodních látek z přírodních materiálů pomocí superkritických médií, např. superkritického oxidu uhličitého. Výhodou superkritického oxidu uhličitého je možnost jeho recirkulace v extrakční aparatuře a snadné odstranění z extraktu, protože za normálních podmínek je to plynná látka. Superkritický oxid uhličitý je schopen extrahovat z přírodního materiálu celou řadu sloučenin v širokém spektru jejich polarity, od nepolárních až po polární látky. Rovněž některé steroidní sloučeniny již byly takovými postupy z přírodního materiálu získány. Fytosteroidní sloučeniny, které je možné takovým postupem z řady hospodářských rostlin získat (tématická oblast 1.6 programu NPV II), dávají možnost jejich využití při vývoji a produkci supramolekulárních struktur, které díky svým očekávaným vlastnostem mohou významně přispět k dalšímu rozvoji materiálů použitelných v biologii i medicíně.
Cíle projektu:
Na řešení projektu se vedle vědeckých pracovníků podílí řada studentů všech stupňů vysokoškolského studia, pracujících v zúčastněných pracovištích. Nelze opomenout ani spolupráci s dalšími institucemi v České republice (např. s Universitou Palackého v Olomouci (www.upol.cz ), Českou zemědělskou universitou v Praze (www.czu.cz ), Biologickým centrem AV ČR, v.v.i. v Českých Budějovicích (www.entu.cas.cz ) atd.) Významná je mezinárodní spolupráce se zahraničními universitami, kde mají studenti možnost pracovat v rámci studijních pobytů (např. na Universitě v Jyväskylä ve Finsku (www.jyu.fi ; Prof. Dr. Erkki Kolehmainen), Universitě v La Rochelle ve Francii (www.univ-larochelle.fr ; Prof. Sobolik) i jinde).
Seznam pracovišť používajících značené látky připravené laboratoří v letech 1999-2007
Evropa:
Asie:
Afrika:
Severní Amerika:
Jižní Amerika:
Austrálie:
PATENTY:
Čeština
English
