Vědci z Ústavu organické chemie a biochemie AVČR (tým doc. Michala Hocka) vyvinuli novou metodiku, jak lze chemickou cestou regulovat stříhání řetězců DNA selektivními enzymovými nůžkami. Štěpení DNA tzv. restrikčními endonukleázami je základním postupem při klonování DNA, bez kterého si nelze představit moderní molekulární biologii a genomiku.Tato metodika by mohla usnadnit řadu aplikací v molekulární biologii vyžadující štěpení velkých úseků DNA.
Vědci z týmu doc. Michala Hocka vyvinuli postup přípravy „obalené" DNA, která sice
obsahuje genetickou informaci, ale zvenku je pokrytá objemnými chránícími skupinami, a není tedy
rozpoznatelná pro štěpící enzymy (restrikční endonukleázy). Po jednoduché chemické reakci takto
ochráněné DNA s amoniakem se objemné chránící skupiny odštěpí a nově vzniklou „obnaženou" DNA je
opět možné štěpit endonukleázami.
DNA je biologická makromolekula, která je nositelkou genetické informace. Tvoří ji dvoušroubovice dvou vláken. Klonování úseků DNA pro velkou část molekulárně-biologických aplikací vyžaduje sekvenčně specifické stříhání a poté zase slepování částí DNA (genů). Pro štěpení se využívají tzv. restrikční endonukleázy, což jsou bakteriální enzymy, kterými se bakterie brání proti virům. Tyto enzymy specificky rozpoznávají a štěpí krátké (4-8 nukleotidové) sekvence, zatímco všechny ostatní sekvence DNA zůstávají netknuté.
Nová metodika vědců z ÚOCHB AVČR umožňuje, aby určité části DNA byly dočasně před štěpením
ochráněny, ale kdykoli je třeba, lze ochráněnou DNA opět obnažit a poté štěpit na požadovaném
místě. Metoda přípravy chráněné DNA je velmi rychlá a skládá se z pouhých dvou stupňů. Prvním
krokem je příprava chráněného stavebního kamene DNA (nukleosid trifosfátu) a druhým enzymatická
výstavba DNA z těchto stavebních bloků katalyzovaná enzymem zvaným DNA polymeráza. Pomocí
polymerázové řetězové reakce (tzv. PCR) lze připravit jakoukoli sekvenci DNA, která bude obalená
objemnými chránícími skupinami. Takto ochráněná DNA je odolná vůči štěpení restrikčními
endonukleázami, přestože obsahuje rozpoznávací sekvence pro daný enzym. Pokud ovšem podrobíme tuto
DNA reakci s amoniakem, odštěpí se všech objemné silylové chránící skupiny a vzniklá DNA
modifikovaná pouze malými molekulami acetylenu je už dále rozpoznatelná pro restrikční enzymy a
štěpí se v příslušných rozpoznávacích sekvencích. Jedná se o první případ přepínatelného chránění
DNA před štěpením a v širším smyslu i před specifickou interakcí s proteinem. Vypínání a zapínání
štěpení endonukleázami lze využít při molekulárně-biologických manipulacích velkých úseků DNA, kde
se rozpoznávací sekvence mohou vyskytovat ve více kopiích. Tým doc. Hocka nyní bude studovat
možnost přepínání interakce i dalších enzymů a proteinů vážících se na specifické sekvence DNA a
případné využití tohoto jevu v regulaci biologických procesů.
Další informace:
Doc. Ing. Michal Hocek, DSc., Ústav organické chemie a biochemie AVČR, v. v. i., Flemingovo
nám. 2, 16610 Praha 6, tel. +420 220 183 324, e-mail:
hocek@uochb.cas.cz
Publikace: Kielkowski, P.; Macíčková-Cahová, H.; Pohl, R.; Hocek, M. "Transient and switchable
(triethylsilyl)ethynyl protection of DNA against cleavage by restriction endonucleases"
Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 8727-8730. doi: 10.1002/anie.201102898.
Připravil Odbor mediální komunikace (Kancelář AV ČR) a ÚOCHB AV ČR
1 Sep 2011
