Letošní jaro přišlo brzy. Stejně brzy odvanulo něžné kvetení jabloňových sadů, pohasly šeříky, opadaly růžově a bíle rozžehnuté svícínky kaštanů, začala usychat voňavá krása akátů. Jak se děje všechno to rašení, kvetení, odkvétání? Díky čemu? A proč i mimo svůj obvyklý čas? Tak se ptají nejen milovníci přírody, ale i vědci, například doc. Jan Krekule, který nedávno (loni v zimě) oslavil pětasedmdestátiny a většinu života věnoval spolu se svým týmem v Ústavu experimentální botaniky AV ČR v Praze právě kvetení. Zkoumání apikálního meristému, jímž je vrchol lodyhy tající květ, a hledání klíče k tajemství florigenu, látky působící kvetení, byly a zůstávají \"jeho námětem\", stejně jako pro něho botanika je a vždycky bude \"ars amabilis\", zázrak všech zázraků. Úvodní otázka zní: jak se stane, že se příroda začne probouzet mimo svůj kalendářní čas?
Jistě máte na mysli všechna ta barevná překvapení, která jsme s nepatřičným předstihem zažili již během letošní zimy. V polovině ledna kvetla na Újezdě okrasná třešeň, o nějaký týden později se na Karlově náměstí objevily první kvítky kaliny vonné (opravdu voní) a v zatáčce Chotkovy silnice potěšily cestující tramvají žluté květy jasmínu nahokvětého. Z trávníků prakticky za celou zimu nevymizely sedmikrásky, v chráněném stanovišti dvorků kvetl v prosinci vlaštovičník či hluchavky a všudypřítomný ptačinec. Zdánlivě banální odpověď napadne každého – teploty zimních měsíců o několik stupňů překročily dlouhodobý průměr. Poupata raných dřevin a keřů jsou každým rokem připravena rašit, a dokonce i kvést už koncem roku či v lednu. Zimní spánek, do kterého jsou uváděna především vnějšími signály jako je zkracující se den či snižující se teploty (o vnitřních, hormonálních mechanismech teď mluvit nebudeme) je projevem adaptace, jež zabraňuje rašení v podzimních podmínkách. Působení teplot nad nulou v průběhu listopadu a ledna u většiny dřevin zimní spánek přeruší a rašení může zabránit jen nástup zimních podmínek, nízké teploty.
Že příroda vtiskla rostlinám povědomí o tom, jak stavět podzemní část, zárodečný kořínek, a nadzemní část, stonek se zárodečnými listy kryjícími vrcholový meristém, pletivo činné během celého života rostliny, obdivujete jako každý, kdo má oči pro krásu přírody, tvořící "přímo s hýřivou rozmanitostí". Že jsou rostliny pod vlivem přírodních podmínek a mohou svým chováním "předvídat" průběh sezonního klimatu – tím jste se zabývali ve Vašem ústavu řadu let na vědecké úrovni.
Jistě, to patřilo k našim učednickým letům. Nebyla lehká. Především chyběly adekvátní nástroje – klimaboxy či celé klimatizované skleníky s různým světelným a teplotním režimem jednotlivých kójí (fytotrony), jež by simulovaly proměnlivost délky dne a teploty. Zčásti jsme se změnili na nucené konstruktéry, a díky řemeslníkům z Vývojových dílen ČSAV i dílen jednotlivých ústavů – kdo si dnes již vzpomene na ty nápadité lidi s tvůrčím zápalem i starobylým řemeslnickým fortelem – získali i ony nástroje. Vznikala tak nejen amatérská náhražka, ale konkurent v zahraničí vyráběných (pro nás tehdy nedostupných) klimaboxů.
A co jsme studovali? Nejprve jsme experimentovali se pšenicemi, naším nejsložitějším modelem. Přinesl i zajímavé poznatky o tom, jak lze požadavek nízkých teplot, jarovizaci, nahradit krátkým dnem, či jak délka dne rozhoduje o morfologických znacích klasu. Nespornou autoritou v této problematice byla tehdejší vedoucí naší laboratoře Lola Teltscherová.
Otázku závislosti kvetení na teplotách a délce dne jsme studovali také u skupiny rostlin v Českém krasu, terofytů, které jsou charakteristické krátkou vegetační dobou a kvetou většinou časně. Sledovali jsme jejich kvetení na přirozeném stanovišti i v klimaboxech. Výsledný poznatek, posléze hojně citovaný v literatuře, jednoznačně ukázal, že i u omezeného vzorku druhů (8), kvetoucích v přibližně stejném období, existuje rozmanitost kontroly kvetení vnějšími podmínkami. Jednou jde jen o výrazný požadavek jarovizace (penízek prorostlý), jindy o kombinaci jarovizace a potřeby dlouhého dne (kamejka rolní), u hluchavky objímavé je doba kvetení závislá pouze na době klíčení. Důležité ponaučení o rozmanitosti vývoje.
Již na samém počátku studia kvetení jste se setkali s celou řadou rostlinných druhů. Který z nich se stal nakonec pro Vás tím vyvoleným a proč?
Druhy, u nichž jsme studovali fenomenologii indukce či inhibice kvetení ve vztahu k vnějším podmínkám, nebyly vhodné pro detailnější fyziologická studia, představovaly příliš hrubý model. Doba potřebná k tomu, abychom vyvolali kvetení nízkými teplotami či délkou dne, se počítala na celé týdny, i sama diferenciace květních orgánů byla pomalá. Obtížné bylo také stanovení pevného bodu, od něhož by se vývoj krokoval. V té době – před více než padesáti lety – se jako výhodné nástroje studia kvetení uplatnily a uplatňují se v menší míře dodnes druhy s výrazným fotoperiodickým požadavkem (tj. závislým na délce dne) indukce kvetení, především krátkodenní druhy jako řepeň (Xanthium) nebo tropický svlačec (Pharbitis nil), z dlouhodenních tráva, jílek mámivý či hořčice. Tyto druhy splňovaly základní požadavek – daly se přizpůsobit tak, aby jako spouštěcí mechanismus postačil jeden krátký den (u krátkodenních), či jeden dlouhý den (u dlouhodenních).
Hledali jsme malé rostliny a vyhověl nám z Kanady získaný ekotyp domácího druhu merlíku červeného (Chenopodium rubrum) – nenápadná, skoro plevelná rostlina pozoruhodné vývojové a růstové plasticity, kvetoucí jen na krátkém dni. V přirozených podmínkách se setkáte i s košatými exempláři přes metr vysokými, dokáže však vykvést též jako malá rostlina, která neměří více než půldruhého centimetru. Drezúra pro manéž ekologického experimentování trvala dlouhé měsíce, ale výsledek předčil očekávání. V živném roztoku, který vyplňoval nádobky na výrobu ledu v mrazáku, rostlo a kvetlo na nitěné podložce o ploše necelých dvou centimetrů deset až dvanáct rostlin. To vše v kontrolovatelných podmínkách více jak tuctu miniklimaboxů, jež pro nás vyrobily s naším přispěním konstruktérů-amatérů ústavní dílny. Pražský mikrofytotron, kde v jednom prostoru žily stovky rostlin, byl prostředím, v němž jeden krátký den vyvolal kvetení! Zůstali jsme tomuto modelu s řadou drobných obměn věrni více jak čtyřicet let.
Po čase získal merlík červený dlouhodenního bratříčka, merlík zední (Chenopodium murale), příbuzného velmi podobných biologických vlastností, vhodný objekt pro srovnávání dvou rozdílných fotoperiodických kategorií.
Co jste se chtěli od merlíku dozvědět a jak ta malá obyčejná rostlinka splnila Vaše očekávání?
Nejpřirozenější se zdá být soustředění badatelského zájmu na místa, v nichž k tvorbě květů dochází – na apikální meristém. U mnohých rostlin jde jen o pár set meristematických buněk ve vrcholové části. V průběhu celé vegetace je tu živá dílna tvorby nových orgánů. Ve vegetativním období se z povrchových vrstev tuniky diferencují listy a v jejich úžlabí pupen, jeden ze základních panelů, z nichž je složena tvarová rozmanitost rostlin. Při přechodu do reproduktivní fáze se aktivuje buněčné dělení v celém meristému, vznikne květ, později semena či plody a životní cyklus většinou u bylin končí. Předmětem zájmu je povaha signálu, který programuje přestavbu apikálního meristému, a zároveň povaha prvních anatomických a cytologických změn, k nimž při tom dochází.
Snad trochu překvapivě se výchozím bodem pro studium kvetení nestal meristém, ale list. Vedlo k tomu pozorování moskevského profesora M. Ch. Čajlachjana ze třicátých let minulého století. Zjistil, že k vyvolání kvetení krátkodenních rostlin stačí vystavit příslušné délce dne (fotoperiodě) jediný list. Navíc se ukázalo, že naroubování nekvetoucí rostliny na kvetoucí podnož vyvolá u roubu kvetení. Stimulus, který se roubováním přenášel, se zdál být univerzální. Fungoval spolehlivě při "přenosu" kvetení mezi rostlinou krátkodenní a dlouhodenní i mezi příbuznými druhy. V kvetení se tedy angažovala celá nadzemní část rostliny. Z listů, kde vzniká, je stimulus kvetení transportován vodivými svazky, floémem, do apikálního meristému, aby inicioval jeho přestavbu. Profesor Čajlachjan nazval tento stimulus kvetení florigenem. Honba za florigenem, snaha identifikovat jeho chemickou povahu, se pak na více jak čtyřicet let stala leitmotivem výzkumu kvetení, na němž jsme se rovněž podíleli.
Znamená to, že jste v rámci "mainstreamové" vlny ponechali stranou procesy tvorby květů, děje v apikálním meristému, a soustředili jste se na hledání látky, která je oživuje? Na objevení klíče, jenž odemyká tajemství růstu a kvetení bylin?
To snad platí jen pro závěrečné období naší práce. Na rozdíl od většiny laboratoří, které se touto problematikou zabývaly, bylo pro většinu našeho experimentování charakteristické pojetí nástupu generativní fáze jako velmi komplexního procesu, v němž interagují všechny orgány rostliny. Takové pojetí umožňovala biologická flexibilita, abych použil současného klišé, našeho merlíku. Zjistili jsme na příklad, že indukční fotoperiodu kvetení přijímají nejen listy, ale i samotné řapíky listů, navodili jsme též experimentálně situace, kdy odstranění kořenů vyvolalo kvetení. Nezanedbávali jsme ani apikální meristém a usilovně jsme mu vnucovali různé náhražky florigenu, především rostlinné hormony a jejich kombinace. Merlík se nenechal ke kvetení zlákat.
Vlastní studium meristému zjišťovalo rychlost a lokalizaci buněčného dělení v počátečním období po fotoperiodickém zásahu, který měl prahovou či podprahovou hodnotu – hájemství Fridety Seidlové. Jako jedni z prvních jsme se pokusili získat analytické údaje o samotných apikálních meristémech. O těch, které mají kvést, i o těch, jimž "nesprávná" fotoperioda v kvetení brání. Šlo o filigránské kutění na izolaci desítek či stovek mikrogramových objektů a o modifikace běžných metodických postupů na jejich mikroverze. Zahrnuta byla i konstrukce vlastních torsních vah na vážení nevažitelného. Stanovovali jsme na příklad pomocí mikrorespirometru dýchání apikálních meristémů v průběhu indukce kvetení. V sedmdesátých letech jsme se připojili k tehdy pionýrským pokusům o molekulárně-biologická vysvětlení. Analyzovali jsme změny celkové DNA i kolísání frakcí RNA v apikálních meristémech v souvislosti s fotoperiodickým zásahem polyakrylamidovou elektroforézou na podložních sklíčkách. Správné teoretické předpoklady snoubící se s naivními metodickými postupy. Jejich rozlišovací schopnost byla o řády vzdálená zachycení změn, o jejichž existenci jsme nepochybovali. Nicméně i získané výsledky přinesly řadu publikací. Očekávaná vysvětlení přišla až s vývojem nových metodických nástrojů o více jak deset let později. V tom vlaku jsem ale již neseděl.
Jak zatím pokračovalo slibované dobrodružství s florigenem?
Poznamenejme, že i předmět oné honby měnil s časem svou podobu. Ačkoli stále existovali pravověrní florigenisté, zastánci představy univerzálního květního stimulu, převahu nakonec získal názor z vývojové dílny prof. Berniera v Lutychu. Uváděl, že květní stimulus má více komponent a že teprve jejich přesně časovaná sekvence mění morfogenetický program apikálního meristému. Jednotlivé složky onoho procesu jsou pak rostlinné hormony, cukry i polyaminy. My jsme se v našem týmu experimentálně dotkli klasické představy florigenu ve chvíli, kdy extrakt z kvetoucích tabáků, poskytnutý laboratoří profesora Čajlachjana, vyvolal úplné kvetení našeho merlíku a zcela nahradil nezbytný fotoperiodický podnět. Kromě satisfakce z prestižní publikace přišla i deziluze: zmíněný efekt se v původním rozsahu již neopakoval. Naše další směřování se týkalo analýzy zástupců dvou hormonálních skupin, auxinu a cytokininů. Bezprostřední vztah ke kvetení mají cytokininy svou úlohou v regulaci buněčného dělení (přestavba meristémů). Auxiny naopak část projevů spojených s kvetením (např. tvorbu pupenů) inhibují. Rozsáhlé srovnávací studie kolísání cytokininů v různých orgánech krátkodenního i dlouhodenního merlíku měly ukázat specifické projevy zahájení reproduktivního vývoje. Většinou však šlo o bezprostřední reflexi režimu světla či tmy. Výjimkou byly vrcholové části rostliny (apikální meristém a nejmladší listy), u nichž podmínky předcházející kvetení navozovaly výrazný vzestup hladiny cytokininů. Situace, které kvetení vylučovaly, indikoval nárůst auxinu. Pro nás to byly uspokojivé výsledky získané především v režii kolegyně Ivany Macháčkové. Vzdor tomu zůstávaly nejasnosti, kde se v kauzálním řetězci vlastně nacházíme a zda jsme s ohledem na vlastní florigenní efekt blíže příčinám, či následkům.
K florigenním signálům jsme se přibližovali i zcela rozdílnou metodickou cestou, elektrofyziologicky. Inspirováni poznatky kolegů z ženevské univerzity jsme zjistili, že stejnosměrný elektrický proud u merlíku anuluje fotoperiodickou indukci kvetení. Účinnost takového zásahu byla závislá jak na polaritě proudu – katoda musí být u kořenů, anoda na listové čepeli či řapíku – tak na době kdy působí. Citlivým obdobím je druhá polovina dlouhé noci a několik následujících hodin. Nasnadě bylo vysvětlení, že dochází k narušení transportu florigenního stimulu. Náročné pokusy sledující v tomto kontextu transport látek nás florigenu nepřiblížily.
Pokračování této elektrofyziologické anabáze následovalo v Krakově, kde se nám ve spolupráci s polskými kolegy podařilo využít u řepky elektrického proudu opačné polarity i k nahrazení fotoperiodického signálu, k vyvolání kvetení. Fenomén, na jehož hodnocení se i dnes osobně podílím. Do této oblasti patří i dřívější práce naznačující vliv elektrického signálu na rušení endogenního rytmu kvetení, který je u merlíku výrazně vyvinut. Širší elektrofyziologický rámec měly pokusy kolegy Luboše Adamce, který testoval spojení indukce kvetení se změnou elektrických potenciálů.
Široce jsme se u merlíku zabývali endogenní rytmicitou kvetení, její charakteristikou i vztahem k fluktuaci fytohormonů. I v konstantním prostředí, například v dlouhodobě působící nepřetržité temnotě, se totiž opakovaně střídají fáze, kde je rostlina ke kvetení "připravena" a kde je inertní – tedy biologické hodiny.
Závěrečnou kapitolou této tématiky, již bez mé účasti, byla snaha zjistit u merlíku i dalších druhů úlohu melatoninu v kvetení. Jde o sloučeninu, která generuje endogenní rytmy živočichů. Také s našim přispěním (Jan Kolář, Ivana Macháčková) byl melatonin objeven i u vyšších rostlin. A jeho úloha v regulaci kvetení? Zatím nedokončená etuda s několika pozitivními indiciemi.
Jakou má podle současných představ florigen, gen kvetení, vlastně podobu?
Trochu překvapivě se odpověď vrací k původní čajlachjanovské představě. Rozuzlení poskytla v posledních letech molekulární biologie s využitím pro rostlinné biology závazné modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). Huseníček, protagonista současného rostlinného výzkumu, má velmi malý genom, který byl jako první u rostlin přečten, sekvenován. Molekulární biologie u tohoto druhu identifikovala za pomoci mutací a klasické genetiky několik desítek genů, které regulují přechod do reproduktivní fáze, určují dobu kvetení. Jsou seřazeny do hierarchických okruhů obsahujících skupiny reagující na vnější podněty i geny "obstarávající" vnitřní, autonomní regulaci kvetení. A rozluštění hádanky? Původní představě florigenu nejlépe odpovídá produkt genu FT (Flowering time), "malá" bílkovina. K její syntéze dochází v čepelích či řapících listů pod vlivem genu CO (Constans). Objev v této podobě starý pár týdnů je happy endem florigenového hledačství. Léta se hledaly jednoduché molekuly, nejspíše hormonální povahy, aby se nakonec ukázalo, že makromolekulu je možné symplasticky floemem transportovat do apikálního meristému i z listů. O tom si ale my, nejstarší generace, jen čteme. Pokračovatelem nekončící otázky Proč kvetou rostliny je dnes na našem ústavu Helena Štorchová, která srovnává analogie genové regulace kvetení u merlíku a huseníčku.
Co říci při ohlédnutí za Vaší prací a za prací Vašeho týmu, za zápasy, zklamáními a opětovném vykročení k nové naději, za dobrodružstvím nejen při hledání florigenu, ale při veškerém objevování řádu přírody, nad nímž můžeme jen žasnout a z jehož projevů v kvetení se smíme radovat?
Jak již uvádím na začátku, příroda je pestrá. Zatím se zdá, že co platí pro huseníček, platí i pro rýži a snad i merlík a další rostliny. Ale australští kolegové dokázali, že pro jílek mámivý jsou florigenem rostlinné hormony, gibereliny. Sám vzpomínám na osobní zkušenost z Afriky při výzkumu kvetení tropického kakaa, u něhož se vytvářejí květy přímo na kmeni či větvích stromu. O kvetení tam rozhoduje jednoznačně výživa. Pochybuji, že by tady mohl být modelem huseníček. Obrovský kus práce čeká vědce při identifikaci fyziology vytvořené interpretace kvetení s genovým schématem.
A moralita? Opakovaně jsme na naší cestě byli schopni vysvětlit, proč rostliny kvetou v rámci stávajících teoretických koncepcí. Následný posun naše poznatky nevymazal, ale zařadil je v novém schématu, na jiná místa a dal jim jinou váhu. A opět jsme dokázali vysvětlit, proč rostliny kvetou a tak da capo al fine. Rostliny člověka potěší, naše věda je scientia amabilis, ale tím vůbec nejhezčím bylo vždy setkání s kolegy, kteří se na bádání o společném problému podíleli.
Sylva Daníčková
English
