Nejbližší akce

1.10.2011 16:00 IV. Astronomický den v Jizerské oblasti tmavé oblohy

3.10.2011 - 5.10.2011 Řezání vodou - téma, které zajímá kameníky i lékaře

4.10.2011 19:30 Science Café o behaviorální ekonomii - Psychologie a ekonomie: sestry, co se nemají v lásce

Kalendář akcí

Dnes < 2011 >  < říjen > 
Po Út St Čt Pá So Ne
          1 2
3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28 29 30
31            

Důležité odkazy

section-box-04-bg.jpg

Akademický bulletin

abicko

Videa ze světa vědy

videoprezentace-blok-bgd.jpg

projekt BIOCEV

 

Get the Flash Player to see this player.

Více o projektu

RSS  

feed-icon-28x28.png    

 

 

5. Sekce biologických a lékařských věd

Seznam anotací:

  1. Detekce bodových mutací pomocí elektrochemického biosensoru s imobilizovanou peptidovou nukleovou kyselinou (BFÚ)
  2. Nový vztah mezi strukturou a farmakologickou aktivitou komplexů platiny (BFÚ)
  3. Modulace metylačního stavu rostlinného genomu faktory vnějšího prostředí (BFÚ)
  4. Analýza genů kódujících hedvábí (ENTÚ)
  5. Fylogeneze členovců: vznik a evoluce základního stavebního plánu (ENTÚ)
  6. Modelování některých zákonitostí přírodní rovnováhy (ENTÚ)
  7. Studium imunologických aktivit protivirově účinných látek (FKÚ)
  8. Stárnutí a faktory vnějšího prostředí (FGÚ)
  9. Nové mechanismy regulace muskarinových receptorů (FGÚ)
  10. Molekulární mechanismus funkce mitochondriálních rozpřahujících proteinů a jejich význam pro kontrolu množství tukové tkáně (FGÚ)
  11. Enzymová příprava derivátů chitooligomerů a jejich imunomodulační aktivita (MBÚ)
  12. Protinádorový a antiparazitární faktor izolovaný z dešťovek Eisenia foetida (MBÚ)
  13. Biofyzikální, molekulárně biologické a ekologické studium fotosystému II (MBÚ)
  14. Charakterizace jednoho z klíčových regulátorů buněčné sekrece u rostlin (ÚEB)
  15. Úloha auxinů a cytokininů v regulaci tvorby hlíz bramboru (ÚEB)
  16. Extracelulární prostor v CNS: Regulace iontového složení, objemu a geometrie během fyziologických a patologických stavů (ÚEM)
  17. Vliv znečištěného ovzduší na výsledky těhotenství (ÚEM)
  18. Silové pole pro výpočty molekulárních struktur protivirových a protinádorových preparátů s kovalentní vazbou na nukleové kyseliny (ÚMBR)
  19. MN protein jako terč pro vývoj protinádorových látek (ÚMG)
  20. Mechanismus indukce nádorového růstu myeloidních buněk při experimentální leukemii (ÚMG)
  21. Genová léčba zbytkové nádorové choroby (ÚMG)
  22. Geneticky modifikované bachorové bakterie chrání ovce na pastvě před otravou fluoroacetátem (ÚŽFG)
  23. Knockout cyclinu A2 (ÚŽFG)
5.1 Detekce bodových mutací pomocí elektrochemického biosensoru s imobilizovanou peptidovou nukleovou kyselinou
Řešitel: Emil Paleček
Jedním z nejdůležitějších cílů současného biotechnologického výzkumu je navržení jednoduchého biosensoru pro detekci specifických sekvencí DNK, který by byl užitečný v lékařství, ekologii, kriminalistice apod. Skupině z Biofyzikálního ústavu vedené E. Palečkem se ve spolupráci s laboratoří P. Nielssena v Dánsku a J. Wanga v USA podařilo dosáhnout výrazného zvýšení rozlišovací schopnosti elektrochemického DNK-biosensoru použitím peptidové nukleové kyseliny (PNK) namísto DNK. Studium elektrochemického chování PNK na rtuťových a uhlíkových elektrodách ukázalo, že PNK se pevně adsorbuje na povrchy obou typů elektrod. Imobilizovaná PNK si na povrchu uhlíkové elektrody zachovává svoje vlastnosti, které u ní byly pozorovány v roztoku, zejména svou schopnost vytvářet s komplementární DNK duplexy.
Tato schopnost PNK byla využita k navržení elektrochemického biosensoru pro hybridizace DNK, který dokáže citlivě rozlišit bodovou mutaci, t.j. záměnu jediné báze v DNK. Pomocí PNK-biosensoru byly detekovány bodové mutace v genu nádorového supresoru p53.
  • Fojta, M., Vetterl, V., Tomschik, M., Jelen, F., Nielssen, P., Wang, J., Paleček, E.: Adsorption of peptide nucleic acid and DNA decamers at electrically charged surfaces. Biophys. J. 72 (1997) 2285-2293
  • Wang, J., Rivas, G., Cai, X., Chicharro, M., Begleiter, A., Mowat, M., Paleček, E., Nielssen, P.: Detection of point mutation in the p53 gene using a peptide nucleic acid biosensor. Anal. Chim. Acta 344 (1997) 111-118.
5.2 Nový vztah mezi strukturou a farmakologickou aktivitou komplexů platiny
Řešitel: Viktor Brabec
Výsledek byl získán při řešení projektů GA AV ČR reg. č. A5004702 a GA ČR reg. č. 307/96/0996
Do nedávné doby se při vyhledávání nových platinových cytostatik vycházelo z předpokladu, že pouze platnaté komplexy s odstupujícími skupinami v konfiguraci cis, mohou být terapeuticky aktivní. Toto paradigma muselo být v nedávné době přehodnoceno díky zjištění, že některé analogy klinicky neúčinného trans-diammindichloroplatnatého komplexu vykazují protinádorovou účinnost. Metodami molekulární biofyziky bylo ukázáno, že neočekávané biologické vlastnosti těchto analogů souvisí s jejich schopností unikátním způsobem modifikovat DNA.
Výsledky jsou shrnuty v následujících publikacích:
  • Brabec, V., Vrána, O., Nováková, O., Kleinwä chter, V., Intini, F.P., Coluccia, M., Natile, G.: DNA adducts of antitumor trans-[PtCl2(E-iminoether)2]. Nucleic Acids Research 24 (1996) 336-341
  • Žaludová, R., Natile, G., Brabec, V.: The effect of antitumor trans-[PtCl2(E-iminoether)2] on B->Z transition in DNA. Anti-Cancer Drug Design 12 (1997) 295-309
  • Žaludová, R., Žákovská, A., Kašpárková, J., Balcarová, Z., Vrána, O., Coluccia, M., Natile, G., Brabec, V.: DNA modifications by antitumor trans-[PtCl2(E-iminoether)2]. Molecular Pharmacology 52 (1997) 354-361
5.3 Modulace metylačního stavu rostlinného genomu faktory vnějšího prostředí
Řešitel: Aleš Kovařík Výsledek byl získán při řešení projektů GA ČR reg. č. 506/93/0353
Na molekulární úrovni byl studován vztah mezi epigenetickou variabilitou a faktory prostředí. V laboratoři jsme na modelových rostlinných systémech simulovali některé v přírodě se vyskytující stresové jevy, jako je vliv nízké teploty a sucha. Zjistili jsme, že DNA-proteinové komplexy (chromatin) mohou podléhat specifickým modifikacím v závislosti na okolních podmínkách. Například bezprostředně po osmotickém stresu se zvýšil obsah metylovaného cytosinu v heterochromatinových úsecích genomu. Bylo zjištěno, že indukovaná hypermetylace je reversibilním dělem, neboť po odeznění stresových podmínek se obnovil "normální" metylační stav genomu. Pokud intenzita stresu přesáhla kritickou hranici, která již nebyla slučitelná se životem buňky, nastaly ve struktuře DNA ireversibilní změny projevující se zejména její pravidelnou fragmentací, která je typická pro apoptózu.
Tyto výsledky ukazují, že faktory vnějšího prostředí mohou modifikovat genetickou informaci prostřednictvím metylačních mechanismů, a tím přispívat k biodiverzitě v přírodě.
Výsledky jsou shrnuty v následujících publikacích:
  • Kovařík, A., Koukalová, B., Bezděk, M., Opatrný, Z.: Hypermethylation of tobacco heterochromatic loci in response to osmotic stress. Theor. Appl. Genet. 95 (1997) 301-306
  • Koukalová, B., Kovařík, A., Fajkus, J., Široký, J.: Chromatin fragmentation associated with apoptotic changes in tobacco cells exposed to cold stress. FEBS Letters 414 (1997) 289-292
5.4 Analýza genů kódujících hedvábí
Komerční hedvábí je složeno z několika bílkovin, které jsou produktem snovacích žlaz některých druhů housenek. Znalost bílkovin hedvábí a příslušných genů je podkladem pro cílené modifikace vlastností hedvábí a ve vzdálenější budoucnosti též pro produkci hedvábí in vitro. Lepivý obal hedvábného vlákna, který je odmyt při zpracování kokonů, je složen z několika sericinů, které se vytvářejí ve středním oddíle žlaz. Osa vlákna, která se zpracovává na komerční hedvábí, je sekretem zadního oddílu žlaz a obsahuje těžký fibroin, lehký fibroin a 2 bílkoviny P25, které se vzájemně liší obsahem cukerné složky. Nově jsme v hedvábí našli 3 menší proteiny, které mají u dvou zkoumaných druhů motýlů obdobné složení aminového konce. Prokázali jsme, že nejméně jeden z nich se tvoří ve středním i zadním oddíle žlaz a proto jsme ho nazvali seroin (sericin-fibroin). Seroin je přítomen jak v hedvábném vlákně, tak v jeho lepivém obalu. Většina génů kódujících bílkoviny hedvábí má poměrně složitou strukturu. Např. gén P25 obsahuje 5 exonů, a u zavíječe voskového jsme v jeho intronech objevili 3 repetice typu SINE, které jsou homologické retroposonu Bm1. Nekódující 3´ oblast génu P25 obsahuje další insert dosud neznámého typu, který je zřejmě typický pro motýly.
  • Yang C., Teng X., Žurovec M., Scheller K. & Sehnal F. (1998) Characterization of the P25 silk gene and associated insertion elements in Galleria mellonella. Gene, in press.
  • Žurovec M., Kodrík D., Yang C., Sehnal F. & Scheller K. (1997) P25 component of Galleria silk. Mol. Gen. Genet., in press.
  • Žurovec M., Yang C. & Sehnal F. (1998) A novel silk protein encoding gene, the seroin, is expressed in the middle and posterior sections of silk glands under hormonal control. J. Biol. Chem., submitted.
Dodatek k anotaci
Exprese seroinu během vývoje kolísá v závislosti na příjmu potravy a hormonálním prostředí: obsah jedinné mRNA je vysoký v obdobích příjmu potravy, klesá během larválního svlékání, je maximální v době předení kokonu a rychle zcela mizí po jeho ukončení. Ukončení transkripce a rychlé vymizení transkriptu je vyvoláno zvýšeným titrem ekdysteroidů a je potlačeno juvenilním hormonem. Oblasti promotorů řídící reakci na hormony dosud nejsou dostatečně prozkoumány - např. v regulační oblasti génu P25 zavíječe jsme nenašli žádné ze sekvencí, které hrají úlohu v ekdysteroidní regulaci génů bource.
Vysoká intensita produkce hedvábí je podmíněna přítomností dostatečného množství ribosomů a tRNA. Podařilo se nám identifikovat první hmyzí gén pro ribosomální protein L5, který společně s 5S rRNA vytváří jednu z komponent ribosomální podjednotky 60S. Buňky snovacích žlaz obsahují vysoká množství mRNA pro L5 protein, který je ukazatelem jejich sekreční kapacity. Po vypředení kokonu a zvýšení titru ekdysteroidů obsah této mRNA rychle klesá, zatímco rRNA a mRNA pro některé bílkoviny hedvábí se dlouho udržují na vysoké úrovni. Pokles L5 mRNA je podle všeho jedním z klíčových faktorů, kterými se v důsledku zvýšení titru ekdysteroidů přeruší produkce hedvábí na úrovni translace.
  • Yang C. & Sehnal F. (1998) Ribosomal protein L5 of Bombyx mori: cDNA sequence and tissue differences in the L5 mRNA content. Insect Mol. Biol., in press.
5.5 Fylogeneze členovců: vznik a evoluce základního stavebního plánu
Analýza fylogeneze mnohobuněčných živočichů založená na kombinaci tradičních a molekulárních dat ukazuje, že evoluční linie členovců a jim příbuzných skupin (Arthropoda, Tardigrada, Onychophora) je blízká "nemathelmintním" kmenům (např. Nematoda), tedy skupinám primárně nesegmentovaným. Segmentace členovců je evoluční novinkou bez bližší souvislosti s ostatními segmentovanými skupinami živočichů (Annelida, Vertebrata); naopak je možno v tělní stavbě členovců hledat známky dimerní tělní stavby "nemathelmintních" skupin. Morfologicko-molekulární fylogenetická analýza členovců potvrdila, že hmyz (Hexapoda) je blíže příbuzný korýšům (Crustacea) než skupině Myriapoda. Blízká příbuznost hmyzu a korýšů umožnila integraci srovnávací morfologie a vývojové biologie obou skupin. Výsledkem je hypotéza, že tělo členovců je rozděleno na dva zásadně odlišné oddíly, protocefalon a protokormus, jejichž hranice probíhá středem mandibulárního článku; první protokormální parasegment je velmi odlišný od zbytku protokormu a obvykle pevně spojen s protocefalem (zřejmě primitivní stavba hlavy členovců); všechny postmandibulární články, včetně maxilárních, tvoří původně homonomní trup; základní tagmatizace těla je fylogeneticky stálejší i ontogeneticky ranější než determinace definitivního počtu tělních segmentů.
  • Zrzavý J. & Štys P. (1997) The basic body plan of Arthropoda: insights from evolutionary morphology and developmental biology.J. Evol. Biol. 10: 353-367.
  • Zrzavý J., Hypša V. & Vlášková M. (1998) Arthropod phylogeny: taxonomic congruence, total evidence, and conditional combination approaches to morphological and molecular data sets. In Fortey R.A. & Thomas R.H. (eds): Arthropod Relationships (Syst. Assoc., Spec. Vol. 55), pp. 97-107. Chapman & Hall, London-Weinheim-New York-Tokyo-Melbourne-Madras.
  • Zrzavý J., Mihulka S., Kepka P. & Bezděk A. (1998) Phylogeny of the Metazoa based on morphological and 18S ribosomal DNA evidence. Cladistics, submitted.
5.6 Modelování některých zákonitostí přírodní rovnováhy
Pro udržení přírodní rovnováhy má zásadní význam vztah mezi zdroji potravy a potřebami konzumentů. Jejich chování při výběru potravy je adaptováno na maximální příjem energie a živin při minimální úmrtnosti. Výslednicí adaptací, které to umožňují, je zdatnost (fitness), jejímž výrazem je množství potomků na jedince. Chování při výběru potravy nutně ovlivňuje populační dynamiku konzumentů i jejich zdrojů. Studiem několika typů adaptivního chování jsme s využitím matematických modelů dokázali, že chování je často podmínkou pro zajištění koexistence vazeb typu dravec-kořist nebo hostitel-parazitoid; bez adaptivního chování není možná dlouhodobá druhové koexistenci. Vztah mezi populací konzumenta a nabídkou potravy není nezbytně stabilizován na konstatní úrovni, ale počty konzumentů a kořisti okolo tohoto rovnovážného stavu oscilují. Teoretické závěry jsme testovali analýzou údajů dvanáctiletého sledování druhového složení a populační dynamiky nočních motýlů v nenarušeném mokřadním lese. Ve shodě s matematickou predikcí se podařilo ukázat, že variabilita velikosti populací v čase je určena bionomickými strategiemi daných druhů, vyjádřenými jako potenciální populační růstová rychlost odhadnutá na základě plodnosti samic. Vliv potravní specializace na kolísání velikosti populací byl malý a korelace mezi velikostí populace a velikostí potravní nabídky byla nalezena jen u specializovaných druhů. U polyfágních druhů byla velikost populace nezávislá na velikosti potravní nabídky.
  • Křivan, V. (1997) Dynamic ideal free distribution: Effects of optimal patch choice on predator-prey dynamics American Naturalist 149: 164-178.
  • Křivan, V. (1997) Dynamical consequences of host-feeding on parasitoid-host dynamics. Bull. Mathemat. Biol. 59: 809-831.
  • Křivan, V. (1998) Effects of optimal antipredator behavior of prey on predator-prey dynamics: Role of refuges. Theoret. Popul. Biol., in press.
  • Křivan, V. & Sirot, E. (1997) Searching for food or hosts: the influence of parasitoids behavior on parasitoid-host dynamics, Theoret. Popul. Biol. 51: 201-209.
  • Lepš, J., Spitzer, K. & Jaroš, J. 1998. Food plants, species composition and variability of the moth community in undisturbed forest. Oikos, in press.
  • Sirot, E. & Křivan, V. (1997) Adaptive superparasitism and host-parasitoid dynamics. Bull. Mathemat. Biol. 59: 23-42.
Popsání základních mechanismů, které vedou k zachování vysoké druhové rozmanitosti na Zemi je důležitým předpokladem pro pochopení rovnováhy v životním prostředí, která je čím dále tím častěji narušována lidskými zásahy. Pro udržení rovnováhy má zásadní význam vztah mezi zdroji potravy a jejich konzumenty. Chování konzumentů je v řadě případů adaptivní, tj. konzumenti se při výběru potravy chovají tak, aby se maximalizoval např. příjem jejich energie, živin, minimalizovala jejich úmrtnost a pod. Tyto vlivy je možné shrnout do jedné agregované veličiny, nazývané zdatnost (angl. fitness) která měří množství potomků pro daného jedince. Je tedy intuitivně zřejmé, že chování jedinců nutně ovlivňuje populační dynamiku konzumentů a jejich zdrojů. Tento vztah mezi behaviorální ekologií a populační ekologií nebyl v literatuře dosud systematicky studován. Jedním z důvodů je také fakt, že nebyla donedávna dostatečně rozvinuta matematická metodologie vhodná pro takové studium. Studiem několika typů adaptivního chování bylo s využitím matematických modelů dokázáno, že chování je často adaptací nezbytnou k zajištění koexistence vazeb typu dravec-kořist nebo hostitel-parazitoid. Stejný modelový systém bez adaptivního chování nevede k dlouhodobé druhové koexistenci. Přitom adaptivní chování samo o sobě nemusí vést nutně ke stabilizaci populační dynamiky v určitém rovnovážném stavu, ale počty konzumentů a kořisti mohou okolo tohoto rovnovážného stavu oscilovat. V rámci vztahů dravec-kořist byly studovány následující typy adaptivního chování na populační dynamiku: vliv výběru loviště dravcem (Křivan 1997a), využívání skrýše kořistí (Křivan 1998), superparazitismus (tj. následné kladení vajíček do jedince, který byl již parazitován, Sirot and Křivan 1997), adaptivní rozhodování mezi kladením vajíček a vyhledáváním potravy (Křivan and Sirot 1997), adaptivní rozhodování mezi nakladením vajíček do hostitele event. jeho konzumací (Křivan 1997b). Z hlediska teoretické populační ekologie se jedná o důležité výsledky přispívající k pochopení základních mechanismů umnožňujících dlohodobou koexistenci dravce a jeho kořisti a hostitele a parasitoida. Tyto teoretické výsledky navíc generují hypotézy, které motivují další experimentální práci v této oblasti.
Jedním z dalších mechanismů vedoucích ke koexistenci dravce a jeho kořisti je poměr generační doby predátora ke generační době kořisti. Nízká účinnost predátora v systémech, kde je hodnota tohoto poměru vysoká, je výhodnou adaptací. "Fitness" dlouhověkého predátora je totiž vzhledem k jeho neschopnosti sledovat změny v dynamice krátkověké kořisti nízká v místech s jeho vysokou populační hustotou, kde navíc snáze dochází ke kanibalismu. Tento závěr má praktický význam pro hodnocení možností využití parasitoidů a dravých druhů hmyzu pro boj s hmyzími škůdci. Z matematického modelu lze odvodit, že ve volné přírodě lze dobrých výsledků dosáhnout pouze v systémech, kde je hodnota výše uvedených poměrů rovna jedné nebo menší.
Některé predikce modelů a ekologické teorie byly testovány srovnáním s dlouhodobými pozorováními: byla využita data o druhovém složení a dynamice můr v nenarušeném mokřadním lese, sledovaná po dobu 12 let. Ve shodě s teoretickými predikcemi se podařilo ukázat, že variabilita velikosti populací v čase je determinována bionomickými strategiemi daných populací, vyjádřenými jako potenciální populační růstová rychlost, odhadnutá na základě plodnosti samic. Vliv potravní specializace na variabilitu je malý. Korelace populační velikosti s velikostí potravní nabídky byla nalezena pouze u specializovaných druhů. U polyfágních druhů byla velikost populace nezávislá na velikosti potravní nabídky (Lepš et al. 1998).
  • Dixon A.F.G., Hemptinne, J.-L. and Kindlmann P. (1997) Effectiveness of ladybirds as biological control agents: patterns and processes. Entomophaga, 42: 71-83.
  • Kindlmann P. and Dixon A.F.G. (199.) GTRs - determinants of prey abundance in insect predator - prey interactions. Eur. J. Entomol., submitted.
5.7 Studium imunologických aktivit protivirově účinných látek
Dr. Z. Zídek
Ve Farmakologickém ústavu byl studován vliv acyklických analogů nukleotidů, vyvinutých v Ústavu organické chemie a biochemie, na imunitní systém. Jedná se o skupinu látek s výraznou protivirovou aktivitou, které, jak již bylo zjištěno na výzkumných pracovištích v zahraničí, mohou inhibovat kromě jiných virů také rozmnožování viru HIV. Jedna z nich dokonce zcela brání rozvoji AIDS v modelu na opicích. Práce Farmakologického ústavu prokázaly, že tato ale i některé jiné příbuzné látky výrazně aktivují buňky, jež hrají významnou úlohu v systému obranných reakcí organismu proti infekcím, a to stimulací faktorů důležitých pro komunikaci mezi buňkami. Zejména jde o produkci faktoru nekrózy nádorů, tzv. TNF-alfa, interleukinu-10 a oxidu dusnatého, které se uplatňují nejen při virových infekcích, ale i v mnoha dalších imunitních reakcích. U několika acyklických analogů nukleotidů byl prokázán i protektivní účinek na rozvoj experimentálního chronického zánětového onemocnění, které slouží jako model lidské revmatitidy.
  • Zídek Z, Franková D, Holý A, Boubelík M and Dráber P: Inhibition of Murine Macrophage Nitric Oxide Synthase Expression by a Pivoxil Prodrug of Antiviral Acyclic Nucleotide Analogue 9-(2-Phosphonomethoxyethyl)adenine. Biochemical Pharmacology, 54:855-861, 1997.
  • Zídek Z, Holý A, Franková D: Antiretroviral agent (R)-9-(2-phosphonomethoxypropyl)adenine stimulates cytokine and nitric oxide production. European Journal of Pharmacology, 331:245-252, 1997.
5.8 Stárnutí a faktory vnějšího prostředí
Výzkumem stárnutí a jeho vztahu k vnějším faktorům se zabývalo oddělení pro výzkum biologicky aktivních látek. Bylo zjištěno, že stárnutí mnohobuněčných organismů lze zpomalit dietním režimem nebo omezením přístupu zvířat k poškozujícím účinkům vnějšího prostředí. Společným jmenovatelem poškozujících faktorů je jejich schopnost rychlé chemické reakce s bílkovinami, případně vytváření depót fyziologicky méněcenných bílkovin. Výsledkem těchto reakcí je blokáda lysinových zbytků v molekulách bílkovin. Jako obranný proces proti těmto změnám bilkovin je možné použít snížení přístupu k potravě (půstu) a omezení vyskytu reaktivních komponent ve vnějším prostředí (dietě). Délku života laboratorních zvířat lze tak prodloužit o 10-20%. Další možností jak docílit zvýšeného přežití je podání látek, které reagují s poškozujícími faktory lépe než vlastní bílkoviny.
  • Deyl Z. and Mikšík I.: The effect of high fat diet upon the production of reactive carbonyls in hypoxic heart. The effect upon connective tissue. Nutr. Res., 16:79-90, 1996.
  • Mikšík I., Novotná J., Uhrová M., Jelínková D. and Deyl Z.: Capillary electrophoresis of large CNBr peptides of fibre forming collagens with special reference to cross-linking. J. Chromatogr. A, 772:213-220, 1997.
  • Deyl Z. and Mikšík I.: Post-translational non-enzymatic modification of proteins. I. Chromatography of marker adducts with special emphasis to glycation reactions. J. Chromatogr. B, 699:287-309, 1997.
  • Mikšík I. and Deyl Z.: Post-translational non-enzymatic modification of proteins II. Separation of selected protein species after glycation and other carbonyl-mediated modifications. J. Chromatogr. B, 699:311-345, 1997.
  • Mikšík I., Zicha J., Kuneš J. and Deyl Z.: Glycation of collagen in hypertriglyceridemic rats. Life Sciences, 60:2119-2127, 1997.
  • Deyl Z., Mikšík I., Zicha J. and Jelínková D.: Reversed-phase chromatography of pentosidine-containing CNBr peptides from collagen. Anal. Chim. Acta, 352:257-270, 1997.
5.9 Nové mechanismy regulace muskarinových receptorů
Při výzkumu muskarinových receptorů se v letech 1996-1997 podařilo dosáhnout dvou závažných objevů. Muskarinové receptory, tj. bílkovinné molekuly v buněčných membránách, zprostředkují např. přenos signálů, kterými nervová soustava dává povely k činnosti žlázám a hladkým svalům v zažívacím traktu, anebo kterými zpomaluje činnost srdce. Až dosud se soudilo, že muskarinové receptory je možno aktivovat z jediného vysoce specializovaného vazebného místa na jejich povrchu, na které se musí navázat signální molekula acetylcholinu anebo molekuly léků, které účinek acetylcholinu napodobují. Nyní se v oddělení neurochemie Fyziologického ústavu podařilo prokázat, že některými látkami je možno aktivovat muskarinový receptor také z dalšího místa na jeho povrchu, označovaného jako alosterické vazebné místo. Dále se podařilo prokázat, že z alosterického vazebného místa je možno působením určitých látek zvýšit citlivost receptoru pro acetylcholin nebo léky, které se používají pro aktivaci receptoru. Tyto objevy otevírají nové cesty k nalezení látek využitelných v lékařské praxi v případech, kdy je žádoucí funkci muskarinových receptorů korigovat, a významně přispívají ke zpřesnění detailních představ o tom, jak fungují jednotlivé molekuly membránových receptorů.
  • Jakubík J., Bačáková L., Lisá V., El-Fakahany E.E., Tuček S.: Activation of muscarinic acetylcholine receptors via their allosteric binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8705-8709, 1996.
  • Jakubík J., Bačáková L., El-Fakahany E.E., Tuček S.: Positive cooperativity of acetylcholine and other agonists with allosteric ligands on muscarinic acetylcholine receptors. Mol. Pharmacol. 52:172-179, 1997.
  • Tuček S.: Is the R and R* dichotomy real? Trends Pharmacol. Sci. 18: 414-416, 1997.
5.10 Molekulární mechanismus funkce mitochondriálních rozpřahujících proteinů a jejich význam pro kontrolu množství tukové tkáně
Celosvětový výzkum v roce 1997 odhalil, že "rozpřahující protein" (UCP1), který řídí energetickou účinnost syntézy ATP a tím i tvorbu tepla v mitochondriích hnědé tukové tkáně savců je pouze jednou z několika bílkovin s podobnou strukturou, které existují v řadě tkání a organismů (UCP1,UCP2 a UCP3 u savců; a PUMP u rostlin). Je pravděpodobné, že mechanismus, kterým je metabolická energie uvolňována v hnědém tuku prostřednictvím UCP1, se uplatňuje i v dalších tkáních, přispívá k řízení metabolickému obratu organismu a ovlivňuje také náchylnost k obezitě. Poslední výzkum v FgÚ přispěl k objasňují molekulárního mechanismu rozpřahujících proteinů v mitochondriální membráně a jejich fyziologického významu v bílé tukové tkáni. Pomocí analogů mastných kyselin, které nemohou přecházet přes membránu v protonované formě, byla podpořena hypotéza, že UCP1 reguluje účinnost energetické přeměny prostřednictvím cyklování mastných kyselin přes vnitřní membránu mitochondrií. Je pravděpodobné, že tímto mechanismem fungují všechny "rozpřahující proteiny" (1-9). Na modelu transgenních myší s ektopickou syntézou UCP1 v bílé tukové tkáni bylo prokázáno, že ovlivnění mitochondriální energetiky "rozpřahujícím proteinem" redukuje rozvoje obezity indukované dietou, genetickým pozadím, či poruchou center v hypothalamu. Menší hromadění tuku přitom není pouze důsledkem stimulace energetického výdeje, ale také změn lipidového metabolismu indukovaných vlivem UCP1 (10-12). Výsledky naznačují, že podobně jako UCP1 by mohl fungovat v bílé tukové tkáni za fyziologických podmínek i UCP2. Účinnost energetické přeměny v mitochondriích samotné bílé tukové tkáně by mohla ovlivňovat lipidový metabolismus a náchylnost k obezitě.
  • [1] Garlid K.D., Orosz D.E., Modrianský M., Vassanelli S. and Ježek, P. (1996) The uncoupling protein conducts fatty acid anions and the mechanism of thermogenesis is regulated fatty acid cycling. J. Biol. Chem. 270, 2615-2620.
  • [2] Ježek, P., Hanuš, J., Semrad, C., and Garlid, K.D. Photoactivated Azido Fatty Acid Irreversibly Inhibits Anion and Proton Transport through the Mitochondrial Uncoupling Protein. J. Biol. Chem. 271: 6199-6205, 1996.
  • [3] Růžička, M., Borecký, J., Hanuš, J., and Ježek, P. Photoaffinity labelling of the mitochondrial uncoupling protein by [3H]azido fatty acid affects the anion channel. FEBS Lett. 382: 239-243, 1996.
  • [4] Schönfeld, P., Ježek, P., Belyaeva, E.A., Borecký, J., Slyschenkov, V.S., Wieckowski, M.R., and Wojtczak, L. Photomodification of mitochondrial proteins by azido fatty acids and its effect on mitochondrial energetics. Further evidence for the role of the ADP/ATP carrier in fatty acid-mediated uncoupling. Eur. J. Biochem. 240: 387-393,1996.
  • [5] Ježek, P., Costa, A.D.T., and Vercesi, A.E. Evidence for Anion Translocating Plant Uncoupling Mitochondrial Protein (PUMP) in Potato Mitochondria. J. Biol. Chem. 271: 32743-32749, 1996.
  • [6] Ježek, P., Modrianský, M., and Garlid, K.D. Inactive fatty acids are unable to flip-flop across the lipid bilayer. FEBS Lett. 408: 161-165, 1997.
  • [7] Ježek, P., Modrianský, M., and Garlid, K.D A structure activity study of fatty acid interaction with mitochondrial uncoupling protein. FEBS Lett. 408: 166-170, 1997.
  • [8] Ježek, P., Costa, A.D.T., and Vercesi, A.E. Reconstituted Plant Uncoupling Mitochondrial Protein (PUMP) Allows for Proton Translocation via Fatty Acid Cycling Mechanism. J. Biol. Chem. 272: 24272-24278, 1997.
  • [9] Ježek, P., Vercesi, A.E., Arruda, P., and Garlid, K.D. Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial uncoupling proteins. Biochim. Biophys. Acta (v tisku).
  • [10] Kopecký, J., Z. Hodný, M. Rossmeisl, I. Syrový, and L. P. Kozak. Reduction of dietary obesity in the aP2-Ucp transgenic mice: physiology and adipose tissue distribution . Am. J. Physiol. 270: E768-E775, 1996.
  • [11] Kopecký, J., M. Rossmeisl, Z. Hodný, I. Syrový, M. Horáková, and P. Kolářová. Reduction of dietary obesity in the aP2-Ucp transgenic mice: mechanism and adipose tissue morphology Am. J. Physiol. 270: E776-E786, 1996.
  • [12] Štefl, B., A. Janovská, Z. Hodný, M. Rossmeisl, M. Horáková, I. Syrový, J. Bémová, B. Bendlová, and J. Kopecký. 1997. Brown fat is essential for cold-induced thermogenesis but not for obesity resistance in aP2-Ucp mice. Am. J. Physiol (v tisku).
5.11 Enzymová příprava derivátů chitooligomerů a jejich imunomodulační aktivita
V. Křen, K. Bezouška, J. Dvořáková, V. Havlíček, T.K. Lindhorst*
* Institute of Organic Chemistry, University of Hamburg, Germany
Kromě receptorů specifických pro peptidové ligandy se v posledních letech věnuje v imunologii mimořádná pozornost studiu receptorů specifických pro sacharidy. Intenzivně byla studována zejména molekula NKR-P1 receptoru (klonovaného), který je důležitým aktivačním receptorem lymfocytů schopným zahájit např. útok na nádorové nebo infikované buňky po vazbě na některé sacharidické ligandy.
Serie chitooligomerů (n=2-9) byla otestována na vazebné schopnosti k NKR-P1 proteinu. Bylo zjištěno, že nejvyšší afinitu k tomuto lektinu má chitotetraosa.
Enzymovými metodami jsme připravili serii derivátů chitooligomerů modifikovaných na neredukujícím konci dalšími cukernými zbytky, např. Glcb (1-4), Glca (1-4), Galb (1-4), Manb (1-4) a další. Pomocí těchto modifikací byly zjištěny strukturální preference tohoto receptoru (pro vazbu je důležitá b -gluko nebo b -manno konfigurace, terminální 2-NHAc skupina není pro vazbu esenciální), další modifikace byly provedeny na redukujícím konci 2-epimerací, čímž byla vytvořena b -ManNAc konfigurace, která podstatně zvyšuje vazbu na protein.
Ve spolupráci s Universitou v Hamburgu byly připraveny odpovídající dendrimery (GlcNAc) - glykomimetika, jejichž afinita k proteinu byla cca o 2 řády vyšší než u nízkomolekulárních ligandů, takže došlo dokonce k precipitaci proteinu. Tyto látky jsou velmi perspektivní pro protinádorovou imunoterapii.
Deriváty chitinu (chitooligomery) jsou důležité signální molekuly u různých typů organismů. Hlízkaté, dusík-fixující bakterie vylučují NOD-faktory (lipochitiny), které působí ve velmi nízké koncentraci diferenciaci kořenového pletiva hostitelských rostlin a tvorbu "nodulů". Nedávno bylo zjištěno, že podobné látky působí jako signální molekuly ve fázi časné embryogeneze u ryb a žab. Naše výsledky naznačují, že tyto látky hrají důležitou roli i v imunitním systému.
Enzymovými metodami byly připraveny nové deriváty chitobiosy až chitopentaosy a jejich pomocí bylo mapováno vazebné místo NKR-P1 proteinu (receptor NK buněk). Byly určeny přesné strukturní parametry vazebného místa pro terminální sacharidickou jednotku. Z výsledků plyne (porovnáním s dalšími výsledky jiných pracovišť), že chitooligomery a jejich deriváty jsou pravděpodobně universálními diferenciačními faktory (např. NOD faktor rhizobií, letos objevená diferenciace rybích embryí). Naše výsledky naznačují důležitou roli těchto nových diferenciačních faktorů i v imunitním systému.
  • E. Rajnochová, J. Dvořáková, Z. Huňková, V. Křen: Reversed hydrolysis catalyzed by b -N-acetyl-hexosaminidase from Aspergillus oryzae. Biotechnol.Lett. 19(9), 869-872 (1997)
  • V. Křen, J. Dvořáková, U. Gambert, P. Sedmera, V. Havlíček, J. Thiem, K. Bezouška: b -Glucosylation of chitooligomers by galactosyltransferase. Carbohydr.Res. - in press (1998)
  • K. Bezouška, J. Sklenář, J. Dvořáková, V. Havlíček, M. Pospíšil, J. Thiem, V. Křen: NKR-P1 protein, an activating receptor of rat natural killer cells, binds to the chitobiose core of uncompletely glycosylated N-linked glycans, and to linear chitooligomers. Biochem.Biophys.Res.Commun. 238, 149-153 (1997)
  • V. Havlíček, C. Kieburg, P. Novák, K. Bezouška, T.K. Lindhorst: Structure analysi of trivalent glycoclusters by PSD MALDI mass spectrometry. J.Mass Spectrom. - in press
  • C. Kieburg, T. K. Lindhorst, V. Křen: Selective enzymatic glycosylation of non-carbohydrate branched polyols. J.Carb.Chem. - submitted
  • K. Bezouška, V. Křen, C. Kieburg, T. K. Lindhorst: GlcNAc terminated glycodendrimers precipitate soluble dimeric receptor of rat natural killer cells, NKR-P1 and stimulate their killing activity. FEBS Lett. - submitted.
5.12 Protinádorový a antiparazitární faktor izolovaný z dešťovek Eisenia foetida
Bilej M., Hanušová R., Šinkora M., Eossmann P., Beschin A.*, De Baetselier P.*
Flemish Interuniversity Institute for Biotechnology, VUB, Brussels
V posledních letech se bezobratlí stávají stále častěji předmětem zájmu vědců, kteří se snaží nalézt alternativní zdroje biologicky aktivních látek. Předpokládá se totiž, že analogické molekuly bezobratlých by mohly mít některé unikátní vlastnosti. Lze například zmínit nový, velice účinný fibrinolytický enzym izolovaný z dešťovek Lumbricus rubellus, který by měl být v současnosti v Japonsku ve stadiu klinického testování jako potenciální trombolytická látka. Velké úsilí je věnováno studiu cytolytických látek, a to zejména těch, které by se mohly uplatnit při nádorové terapii. Mezi takové látky by nesporně patřil nízkomolekulární faktor lombricin, izolovaný z dešťovek Lumbricus terrestris, který inhibuje růst spontánních nádorů u myší. Jiná látka s potenciálními protinádorovými účinky byla patentována chorvatskými autory.
Ve spolupráci s Vlámským meziuniverzitním ústavem pro biotechnologie Svobodné univerzity v Bruselu se nám podařilo z tělní tekutiny dešťovek Eisenia foetida izolovat bílkovinu nazvanou CCF-1, která vykazuje určitou podobnost s obratlovčím faktorem nekrotizujícím tumory. Obě bílkoviny lyzují některé nádorové linie, zvyšuje se jejich hladina po ozáření nebo podání lipopolysacharidu a mají významné antiparazitární účinky proti africkým trypanosomám, které způsobují spavou nemoc u lidí nebo dobytka (nagana). CCF-1 je v současnosti nejúčinnější trypanolytickou látkou přírodního původu.
Byl izolován gen pro CCF-1, který byl klonován v bakteriích a v bakteriích produkovaný rekombinantní CCF-1 vykazuje stále protinádorovou a antiparazitární aktivitu. Rovněž byla odhalena fyziologická úloha CCF-1 u dešťovek.
  • Bilej M., Brys L., Beschin A., Lucas R., Vercauteren E., Hanušová R., Baetselier P.: Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia foetida earthworms. Immunol.Lett. 45, 123-128 (1995)
  • Rossmann P., Bilej M., Tučková L., Starý V., Kofroňová O.: Lesion of leukocytes, erythrocytes and mesothelial cells by coelomic fluid of Eisenia foetida earthworms. Folia Microbiol. 42, 409-416 (1997)
  • Bilej M., Rossmann P., Šinkora M., Hanušová R., Beschin A., Raes G., De Beatselier P.: Cellular expression of the cytolytic factor in the earthworms Eisenia foetida. Immunol.Lett. 1997, in press
  • Beschin A., Bilej M., Hanssens F., Raymarkers J., Revets H., Brys L., Gomez J., De Beatselier P., Timmermans M.: Identification and cloning of a glucan- and LPS-binding protein in Eisenia foetida earthworms involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J.Biol.Chem. - submitted.
5.13 Biofyzikální, molekulárně biologické a ekologické studium fotosystému II
Komenda J., Prášil O., Nedbal L., Masojídek J. a Šetlíková E.
Pokrok bádání v posledním desetiletí ukazuje, že účinnost fotosyntézy nejrůznějších fotosyntetických organismů ve většině případů reguluje druhý fotosystém (dále PS2). To je jeden ze dvou chlorofylo-bílkovinných komplexů, které v membráně oxygenní fotosyntézy uskutečňují primární fotochemickou transformaci energie. Do PS2 soustřeďuje zachycené záření jeho světlosběrný anténní komplex (LHC2).Ve stresových podmínkách, především při nadměrných ozářenostech nebo při vyšších dávkách UV-B záření, je PS2 obvykle ze všech součástí fotosyntetického aparátu nejcitlivější k  poškození a vyřazení z funkce. Je to mimo jiné jedna z příčin odumírání lesních porostů. Proto ve fotosyntetických organismech účinkuje řada ochranných mechanismů, jejichž soustavným studiem se zabýváme. Zjistili jsme, že u smrků má velký význam denní cyklus deepoxidace violaxanthinu na zeaxanthin, která snižuje účinnost přenosu excitační energie z LHC2 do PS2 a tak chrání jehlice před poškozením PS2. U řas pěstovaných v solárních bioreaktorech a rostoucích v přírodních podmínkách jsme dále dokázali, že přeměna violaxanthinu na zeaxanthin odpovídá pouze za část ochranného mechanismu. Účinnost této ochrany závisí na hustotě řasové populace a liší se u různých druhů řas. Řasy s vyšším obsahem karotenoidů se lépe přizpůsobují na vysoké ozářenosti. Pro zachování funkce fotosyntetického aparátu má velký význam také rychlá výměna bílkoviny D1 v reakčním centru PS2, která je obvykle prvou poškozenou složkou PS2. Zjistili jsme, že k této výměně dochází in vivo řízenou souhrou urychlené syntézy D1 a vyříznutí poškozené molekuly D1 serinovou proteasou. Předpokládaný účinek aktivních forem kyslíku při fotochemickém poškození D1 je zřejmě artefakt pozorovaný jen na isolovaných částicích PS2. Nasvědčují tomu naše výsledky s mutanty sinic, kterým chybí v PS2 komplex rozkládající vodu, podobně jako je tomu u isolovaných částic. Ke všestrannému poznání vlastností PS2 přispívají také isolace těchto pigment-proteinových komplexů a jednotlivých jejich složek, zejména vlastního reakčního centra. V získání velmi čistých preparátů takovýchto komplexů a jejich krystalů jsme dosáhli významného úspěchu. Zdokonalili jsme také postup přípravy částic PS2 tak, že se zvýšila jejich aktivita a zejména jejich stabilita. Takové stabilní částice jsme použili pro konstrukci biosensorů. Ty umožňují registrovat nanomolární množství běžně užívaných herbicidů, které jsou inhibitory funkce PS2. Tato detekční metoda má význam pro monitorování znečištění vod, k němuž dochází při aplikaci herbicidů v nadměrném množství nebo v nevhodných geologických podmínkách.
  • Prášil O., Nedbal L., Kopecký J., Masojídek J., Komenda J., Kaftan D., Sprtová M., Marek M.V.: Xanthophyll cycle and photoprotection in Norway spruce (připraveno k zaslání do Tree Physiology)
  • Komenda J.: Photoinactivation of Photosystem II and exchange of the D1 protein in the cyanobacterium Synechococcus PCC 7942: an indication for the role of a serine protease in the selective D1 degradation in vivo. Eur.J.Biochem. - in preparation
  • Komenda J., Diner B.A., Debus R.J., Barber J. and Nixon P.J.: Effect of the Photosystem II donor side mutations, psbA gene copy and glucose on the degradation and synthesis of the D1 and D2 proteins in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Plant Mol.Biol. - in preparation
  • Koblížek M., Masojídek J., Komenda J., Kučera T., Pilloton R., Mattoo A.K. and Giardi M.T.: An Ultrasensitive Photosystem II based Biosensor for Detection of a Class of Herbicides. Biotechnology Bioengineering - submitted
  • Koblížek M., Torzillo G., Kopecký J., Bernardini P., Sacchi A., Komenda J. and Masojídek J.: Photoadaptation of two Chlorophyta (Scenedesmus and Chlorella) in laboratory and outdoor cultures: changes of chlorophyll fluorescence quenching and the xanthophyll cycle. Physiologia Plantarum - in preparation
  • Šetlíková, E., Sofrová, D., Budač, P., Koblížek, M., Prášil, O., Šetlík, I.: Integrity and activity of Photosystem II complexes isolated from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus elnogatus using various detergents. Photosynthesis Research - in preparation
5.14 Charakterizace jednoho z klíčových regulátorů buněčné sekrece u rostlin
Žárský a kol., ÚEB AV ČR, Cvrčková a kol., PřF UK Praha
K významným tématům současné biologie patří otázka, jakým způsobem se tvoří a udržuje nesmírně složité vnitřní členění buňky a jak je usměrňován pohyb makromolekul a jejich komplexů z místa syntézy na místo určení, včetně transportu ven z buňky. Součástí této otázky je také možná shoda či podobnost základních buněčných procesů u různých organismů. V Ústavu experimentální botaniky se výzkum zaměřil na nedávno objevenou třídu signálních bílkovin patřících do okruhu ras protoonkogenu, které regulují řadu buněčných dějů, např. transport buněčných váčků. Cyklus těchto bílkovin je řízen interakcemi s několika dalšími bílkovinami. Ve spolupráci s Přírodovědeckou fakultou UK a Ústavem Maxe Plancka v Kolíně nad Rýnem se podařilo charakterizovat první z těchto bílkovin i v rostlinné buňce, a to tzv. Rab GDP disociační inhibitor, který se váže na Rab bílkovinu v cílové membráně a "vrací" ji zpět do výchozí struktury. Byla přitom použita metoda nahrazení poškozené bílkoviny v buňkách kvasničného mutanta podobnou bílkovinou z buněk modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Výsledky ukázaly, že v oblasti signálních bílkovin mohou být regulační procesy shodné u hub, rostlin i živočichů.
  • Moore I., Diefenthal T., Žárský V., Schell J., Palme K.: A homolog of the mammalian GTPase Rab2 is present in Arabidopsis and is expressed predominantly in pollen grains and seedlings. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94: 762-767,1997.
  • Žárský V., Cvrčková F., Bischoff F., Palme K.: At-GDI1 from Arabidopsis thaliana encodes a rab-specific GDP dissociation inhibitor that complements the sec19 mutation of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters 403:303-308,1997.
  • Žárský V., Cvrčková F.: Small GTPases in the morphogenesis of yeast and plant cells. In: Wirtz K.W.A. (ed.) NATO ASI Series, Vol. H 101, Molecular Mechanisms of Signalling and Membrane transport. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 1997.
5.15 Úloha auxinů a cytokininů v regulaci tvorby hlíz bramboru
Macháčková a kol., ÚEB AV ČR, L. I. Sergeeva a kol., Ústav fyziologie rostlin RAV, Moskva
Hormonální regulace tvorby hlíz u bramboru je problematika velmi významná pro praxi i teoreticky důležitá. Dosud byla iniciace tvorby hlíz spojována se změnou obsahu dvou rostlinných hormonů: poklesem obsahu giberelinů a vzrůstem obsahu kyseliny abscisové. Nám se však podařilo prokázat úlohu dvou nejdůležitějších hormonů - auxinů a cytokininů - v procesu tvorby hlíz. Při studiu jsme použili tři modely: rostliny bramboru in vitro pěstované při různé kvalitě světla (červené nebo modré), rostliny bramboru nesoucí gen pro syntézu cytokininů z půdní bakterie a majících v důsledku toho zvýšený obsah cytokininů a původní planě rostoucí druh bramboru z And Solanum tuberosum, ssp. andigena pěstovaný v půdě ve skleníku. Analýza vlivu aplikovaných cytokininů a auxinů a stanovení obsahu těchto hormonů v rostlinách pěstovaných za různých podmínek ukázaly, že vyšší obsah cytokininů je příznivý pro tvorbu hlíz. Při indukci hlíz se v podzemní části rostlin výrazně zvyšuje i obsah auxinu, a to do té míry, že se obrací obvyklý gradient auxinu, směřující od vrcholu rostliny k její bazi. Vzhledem k důležitosti gradientu auxinu pro morfogenezi může jeho obrácení být významným stimulem nového morfogenetického procesu.Toto studium dává teoretické předpoklady pro využití auxinů a cytokininů v praxi pro zvýšení tvorby hlíz bramboru.
  • Aksenova, N.P., Konstantinova, T.N., Sergeeva, L.I., Macháčková, I., Golyanovskaya, S.A.: Morphogenesis of potato plants in vitro: I. Effect of light quality and hormones.- J. Plant Growth Regul. 13: 143-146, 1994
  • Sergeeva, L.I., Macháčková, I., Konstantinova, T.N., Golyanovskaya, S.A., Eder, J., Zaltsman, O.O., Hanuš, J., Aksenova, N.P.: Morphogenesis of potato plants in vitro: II. Endogenous levels, distribution and metabolism of IAA and cytokinins.- J. Plant Growth regul. 13: 147-152, 1994
  • Macháčková, I., Sergeevea, L., Ondřej, M., Zaltsman, O., Konstantinova, T., Eder, J., Ovesná, J., Golyanovskaya, S., Rakitin, Y., Aksenova, N.: Growth pattern, tuber formation and hormonal balance in in vitro potato plants carrying ipt gene.- Plant Growth Regul. 21: 27-36, 1997
  • Macháčková, I., Konstantinova, T.N., Sergeeva, L.I., Lozhnikova, L.N., Golyanovskaya, S.A., Dudko, N.D., Eder, J., Aksenova, N.P.: Effect of night break on growth, development and phytohormone balance in Solanum tuberosum ssp.andigena.- Physiol. Plant. ,v tisku.
5.16 Extracelulární prostor v CNS: Regulace iontového složení, objemu a geometrie během fyziologických a patologických stavů
Doc. MUDr. Eva Syková, DrSc., vedoucí oddělení neurověd Ústavu experimentální medicíny AV ČR a Ústavu neurověd 3.lékařské fakulty UK
Změny ve složení a geometrii extracelulárního prostoru (ECP), které jsme prokázali v našich pokusech, jsou důsledkem aktivity nervových buněk a iontové homeostázy, kterou zajišťují především gliové buňky. Doprovázejí aktivitu nervových buněk, ale vznikají i následkem anoxie, poranění, epilepsie a dalších patologických stavů v CNS. Tyto změny významně ovlivňují přenos signálů v CNS. Neuronální aktivita nebo poranění CNS vyvolává iontové změny, které spolu s uvolněním aminokyselin vedou k rychlému avšak dlouhodobě trvajícímu zvětšení objemu nervových buněk. Buněčné "nabobtnání" vede ke zmenšení objemu ECP a k poklesu difúzních koeficientů neuroaktivních látek difundujících extracelulárním prostorem. Pohyb substancí zpomalují jednak užší póry, ale i zahuštění makromolekul extracelulární matrix, zvětšení jemných gliálních výběžků a astroglióza, které tak vytvářejí více bariér pro pohyb látek v mozkové tkáni. Směrování pohybu látek, tzv. anizotropie, která je během patologických stavů a stárnutí rovněž narušena, může být příčinou funkčních poruch. Nalezené změny významně ovlivňují efektivitu synaptického a extrasynaptického přenosu, zvyšují hromadění toxických látek, které poškozují nervové buňky a ovlivňují i průnik léčiv do nervové tkáně.
  • Syková, E.: (1997) The extracellular space in the CNS: Its regulation, volume and geometry in normal and pathological neuronal function. The Neuroscientist, 3:334-347.
  • Voříšek, I., Syková, E.: (1997) Ischemia-induced changes in the extracellular space diffusion parameters, K+ and pH in the developing rat cortex and corpus callosum. J.Cereb.Blood Flow Metab.,17:191-203.
  • Chvátal, A., Berger, T., Voříšek, I., Orkand, R.K., Kettenmann, H., Syková, E.:(1997) Changes in glial K+ currents with decreased extracellular volume in developing rat white matter. J.Neurosci. Res.49:98-106.
  • Voříšek, I., Syková, E.: (1997) The evolution of anisotropic diffusion in the developing rat corpus callosum. J.Neurophysiol. 78:912-919.
  • Prokopová, Š., Vargová, L., Syková, E.: (1997) Heterogeneous and anisotropic diffusion in the developing rat spinal cord. Neuroreport 8: 3527-3532.
5.17 Vliv znečištěného ovzduší na výsledky těhotenství
MUDr. Radim Šrám, DrSc., vedoucí oddělení genetické ekotoxikologie Ústavu experimentální medicíny AV ČR
V rámci Programu Teplice II jsou studovány účinky znečištění ovzduší na výsledky těhotenství v okrese Teplice. Byly vypočítány individuální expozice PM10 (prachových částic < 10 .m) pro každou ženu v různých obdobích těhotenství. Byl analyzován vztah rizika růstové retardace plodu (IUGR) ke koncentraci PM10 u 2000 těhotných žen. Uspořádání analýzy dovolilo zjistit, v které fázi těhotenství ovlivňuje expozice prachu růst plodu. Bylo prokázáno, že koncentrace vyšší než 40 .g/m3 zvyšují riziko růstové retardace, pokud působí v prvém měsíci těhotenství. Jedná se o nový poznatek. Je známo, že jedinci s poruchami růstu v prenatálním a časném postnatálním období trpí významně častěji chronickými chorobami v dospělosti (např. hypertenze, ischemická choroba srdeční). Poznatek o vztahu znečištění ovzduší k poruchám růstu plodu proto může ovlivnit představy o prevenci těchto chronických onemocnění. V placentách žen z okresu Teplice a Prachatice byl analyzován vliv genotypu GSTM1 a NAT2 na DNA adukty stanovené metodou 32P-postlabeling. Bylo prokázáno, že DNA adukty v placentách matek GSTM1 negativních jedinců jsou vyšší u matek žijících ve znečištěném okrese Teplice ve srovnání s Prachaticemi. Tento výsledek naznačuje, že určení metabolických genotypů by mohlo umožnit identifikaci vnímavých jedinců v populacích s výrazně znečištěným životním prostředím.
  • J.Topinka, B.Binková, G.Mračková, Z.Stávková, V.Peterka, I.Beneš, J.Dejmek, J.Leníček, T.Pilčík, R.J.Šrám: (1997) Influence of GSTM1 and NAT2 genotypes on placental DNA adducts in an environmentally exposed population. Environ. Molecul. Mutagenesis 30, 184-195.
  • M.Dostál, J. Živný, P.Hartig, J.Dejmek, P.A.Steerenberg, H. van Loveren, R.J.Šrám: (1997) Effects of labour and medication on major lymphocyte subsets in cord blood. Biomarkers 2, 361-365.
5.18 Silové pole pro výpočty molekulárních struktur protivirových a protinádorových preparátů s kovalentní vazbou na nukleové kyseliny
Zdeněk Chval a Miroslav Šíp
Jedním z hlavních mechanismů farmakologicky využívaných k dosažení protivirového a protinádorového účinku je modifikace struktury nukleových kyselin pomocí vhodného činidla kovalentně či nekovalentně na strukturu nukleových kyselin navázaného. Výsledná změna struktury a s ní spojená konformační distorze je rozpoznávána enzymy a projevuje se nejčastěji na úrovni replikace, transkripce a reparační schopnosti modifikovaného úseku nukleové kyseliny.
Látek schopných modifikovat strukturu nukleových kyselin je známa celá řada a neustále se pracuje na syntéze dalších preparátů. Problémem je vybrat z velkého množství možností látky s předpokládaným terapeutickým účinkem a s co nejmenšími nežádoucími efekty. Tento výběr spočívá v přísném laboratorním i klinickém testování a je velmi nákladný. V poslední době pomáhá v prvých fázích testování nových preparátů velmi účinně počítačové molekulární modelování, které dokáže předpovídat výsledné modifikované struktury nukleových kyselin a srovnatelný vliv těchto struktur na molekulární a buněčné funkce.
Počítačové molekulární modelování DNA se s rozvojem výpočetní techniky neustále zdokonaluje a poskytuje v současné době velmi realistický obraz skutečnosti na molekulární úrovni. Hlavním přínosem předkládané práce je podstatné zpřesnění molekulárně mechanických a molekulárně dynamických výpočtů kovalentně modifikovaných n struktur nukleových kyselin. V práci je detailním způsobem pomocí kvantově chemických ab initio metod počítána flexibilita bazí nukleových kyselin a z takto získaných údajů je odvozena parametrizace silového pole. O výsledky práce již projevila zájem zahraniční pracoviště zabývající se výpočty molekulárních struktur a vývojem software pro molekulární modelování.
  • Chval, Z., Šíp, M.: Force Field for Platinum Binding to Adenine and Guanine taking into Account Flexibility of Nucleic Acids Bases, Journal of Physical Chemistry (accepted).
5.19 MN protein jako terč pro vývoj protinádorových látek
Protein MN a gen pro tento protein byly objeveny v Ústavu molekulární genetiky. Gen MN se zřejmě účastní na vzniku řady lidských zhoubných nádorů, např. karcinomu děložního hrdla, ledvin aj. Protein MN má jedinečné vlastnosti, pro které by se mohl stát vynikajícím cílem pro nově koncipované léky některých lidských karcinomů, neboť je přítomen na povrchu buněk a tudíž je snadno přístupný, a dále se nachází v nádorech dostupných imunitnímu systému a látkám podaným do krevního oběhu. Za normálních okolností se však tento protein vyskytuje pouze v žaludeční sliznici, která je těmto látkám nedostupná. Lze si proto představit, že by bylo možné vytvořit takové látky, které by zasáhly pouze nádorové buňky, ale neměly by žádné nežádoucí vedlejší efekty. Úsilí Ústavu molekulární genetiky se proto nyní soustředí na konstrukci takových molekul, které by se specificky navázaly pouze na MN protein a zablokovaly by jeho onkogenní aktivitu.
  • Závada J., Závadová Z., Machoň O., Kutinová L., Němečková S., Opavský R. and Pastorek J. (1997) Transient transformation of mammalian cells by MN protein, a tumor-associated cell adhesion molecule with carbonic anhydrase activity. Int. J. Oncol. 10, 857-863.
  • Liao S. Y., Aurelio O. N., Jan K., Závada J. and Stanbridge E. J. (1997) Identification of the MN/CA9 protein as a reliable diagnostic biomarker of clear cell carcinoma of the kidney. Cancer Res. 57, 2827-2831.
5.20 Mechanismus indukce nádorového růstu myeloidních buněk při experimentální leukemii
Bartůněk P., Karafiát V., Dvořáková M., Záhorová V., Mandíková S., Zenke M. and Dvořák M.
Nádorová bílkovina v-Myb narušuje normální vývoj myeloidních krevních buněk, vyvolává jejich nádorovou transformaci a způsobuje akutní myeloblastickou leukemii u experimentálních zvířat. Cílené změny této bílkoviny, provedené v naší laboratoři, vedly k poznání, že nádorová bílkovina zasahuje do vývoje myeloidních buněk současně na několika úrovních. Vedle toho, že znemožní dozrání buněk do funkčního stadia, abnormálně aktivuje jejich množení tím, že působí jako růstový faktor. Pro toto působení je rozhodující ta část nádorové bílkoviny, která obsahuje doménu nazývanou leucinový zip. Touto doménou se v jádrech myeloidních buněk spojuje nádorová bílkovina s bílkovinou p26/28. Spojené bílkoviny jsou pravděpodobně schopny aktivovat množení buněk. Cílený zásah do struktury nádorové bílkoviny, kterým je oslabena její schopnost vázat p26/28, zpomaluje množení buněk a zcela eliminuje schopnost v-Myb vyvolat myeloblastickou leukemii.
Výsledky umožňují cílené vyhledávání molekulárních interakcí, které přímo souvisejí s nádorovým zvratem.
  • Bartůněk P., Karafiát V., Dvořáková M., Záhorová V., Mandíková S., Zenke M. and Dvořák M. (1997) The Myb leucine zipper is essential for leukemogenicity of the v-Myb protein. Oncogene 15, 2939-2949.
5.21 Genová léčba zbytkové nádorové choroby
V modelovém systému experimentálních sarkomů byl studován léčebný účinek vakcin, připravených vnesením genu pro imunoregulační molekulu interleukinu 2 (IL-2) do nádorové buňky. Zbytková nádorová choroba byla navozena úplnou chirurgickou resekcí nádoru a jedinci s odstraněným nádorem byli v různých časových intervalech po operaci léčeni podáním ozářených buněk téhož nádoru, do nichž byl vnesen klonovaný gen pro IL-2 a které konstitutivně produkovaly interleukin 2. Zatímco u neléčených jedinců rostly nádory v místě operace (recidiva v jizvě) přibližně v 30% případů, při léčbě geneticky modifikovanou vakcinou v období 2 - 5 dní po operaci vznikl jediný nádor u 64 operovaných myší, tj. u 1,6 % případů. Navíc bylo ve stejném experimentálním systému zjištěno, že kombinace vnesení genu pro IL-2 s vnesením genu pro další imunoregulační molekulu, molekulu CD80, zvyšuje léčebný účinek vakciny.
  • Bubeník J., Rössner P., Bubeníková D., Šímová J., Indrová M. and Šloncová E. (1997) Tumour vaccines expressing IL-2, CD80, and IL-2 plus CD80 gene. Int. J. Oncol. 11, 1213-1219.
  • Vlk V., Rössner P., Indrová M., Bubeník J. and Sobota V.: Interleukin 2 gene therapy of surgical minimal residual tumour disease. Int. J. Cancer, v tisku.
5.22 Geneticky modifikované bachorové bakterie chrání ovce na pastvě před otravou fluoroacetátem
Ochranu zvířat na pastvě před rostlinnými toxiny je možno založit na metabolismu anaerobních mikroorganismů trávicího traktu. Jedním ze způsobů, jak otravám předcházet, je přenos nebo stimulace mikroorganismů trávicího traktu, které toxiny rozkládají. Často však nejsou takové mikroorganismy k dispozici anebo v uvedeném prostředí nejsou stabilní. V takových případech je nutné geny detoxikačních enzymů zavést do genomu mikrobů trvale osídlujících zažívací trakt. První projekt využívající pokroku molekulárně-genetických metod je zaměřen na degradaci fluoroacetátu. Tato toxická látka je přítomna v mnoha tropických rostlinách, jako jsou mimosy rodu Acacia (používá se k výrobě arabské gumy a klovatiny), Gastrolobium, Oxylobium a také v jedné z nejjedovatějších rostlin na světě - pryšci Dichapetalum (Chailletia) cymosum (Gifblaar poison) rostoucí v jižní Africe. Letální dávka fluoroacetátu se pohybuje od 0.25 do 0.5 mg/kg živé váhy, což je toxicita vyšší než například u strychninu.
"Fluoroacetátový" projekt se zabývá detoxikací fluoroacetátu, jeho rozkladem na fluorid a acetát účinkem dehalogenázy. Genetickou informaci pro dehalogenázu se podařilo naklonovat do stabilního plasmidového vektoru a tímto vektorem byly transformovány anaerobní bachorové bakterie. Podařilo se vytvořit spolehlivý klonovací systém pro jednu z nejpočetnějších bachorových bakterií Butyrivibrio fibrisolvens. Pro B. fibrisolvens OB 156 byl po mnoha pokusech zkonstruován plasmid pBHf (10.3 kb) nesoucí ampr resistenci z plasmidu pUC118 a ermr resistenci z plasmidu pAMb 1 Enterococcus faecalis, dehalogenasový gen z Moraxely sp., kmen B s erythromycinovým promotorem a plasmidem pRJF1 se dvěmi ORF z kmene B. fibrisolvens OB156.
Bylo naizolováno několik dalších hostitelů uvedeného plasmidu a tyto kultury v pokuse in vivo ochránily hostitele před letální dávkou fluoroacetátu.
  • Kopecny J.; Gregg K.; Harmdorf B.; Henderson K.; Wong Ch. (1997) Genetically modified rumen bacteria protect sheep from fluoroacetate poisoning. Recent Advances in Animal Nutrition in Australia 63-67
5.23 Knockout cyclinu A2
Metodou genové manipulace byly vyprodukovány myši, z jejichž genové výbavy byl odstraněn gen kódující cyklin A2. Tento protein je velice důležitý pro regulaci buněčného cyklu a při jakékoliv poruše jeho funkce se zastavuje buněčné dělení. Křížením myší které byly heterozygotní na tuto deleci (tj. ze dvou alel vždy jedna byla pozitivní na cyklin A2 a jedna byla nulová) byla získana homozygotní embrya, která měla obě alely pro cyklin A2 nulové. Tato embrya byla životaschopná pouze do stadia blastocysty, tj. zhruba do pátého dne embryonálního vývoje od oplození, a poté degenerovala. Z uvedených výsledků vyplývá jednak, že cyklin A2 je zcela nezbytným proteinem pro buněčné dělení a obecně pro normální embryonální vývoj a jednak, že messengerová RNA (mRNA), která kóduje cyklin A2 a jejíž přítomnost je nezbytná pro syntézu tohoto proteinu, přetrvává s největší pravděpodobností v časných embryích (do 5.dne) ze zásob mRNA matky, které jsou nashromážděny v oocytu. Toto zjištění je velice důležité, neboť doposud publikované výsledky uvádějí, že většina zásob maternálních mRNA je po oplození velice rychle rozložena (již v dvoubuněčném embryu) a nové proteiny se syntetizují již na základě přepisu z embryonálních mRNA. Ty se v emryu syntetizují podle informací z embryonální genové výbavy, která je výsledkem sloučení mateřské a otcovské genové výbavy.
  • Murphy M.; Stinnakre M.G.; Senamaud-Beaufort C.; Sweeney C.; Kubelka M.; Carrington M.; Brechot Ch.; Sobczak-Thepot J. (1997) Disruption of the murine cyclin A2 gene results in early embryonic lethality. Nature Genetics 15, 83-86

 

Vyhledávání

Celý intranet Aktuální oblast