Seznam anotací:

1. Struktura chromatinu vyššího řádu a její funkční důsledky (BFÚ)
2. Mutační analýza chromozomálního proteinu HMG-1 (BFÚ)
3. Modulace účinků látek navozujících diferenciaci a apoptózu lidských nádorových buněk (BFÚ)
4. Svlékání hmyzu a hlístic má společný regulátor: jaderný receptor Ftz-F1 (ENTÚ)
5. Biodiverzita vodního hmyzu jako ukazatel stavu životního prostředí (ENTÚ)
6. Entomopatogenní hlístice, jejich rozšíření a význam pro regulaci hmyzích śkůdců (ENTÚ)
7. Výzkum účasti nově popsaných typů 5-HT receptorů v mechanismu neuroimunofarmakologických účinků muramylpeptidů (FKÚ)
8. Význam mitochondrií pro kontrolu množství tukové tkáně (FGÚ)
9. Poruchy rovnováhy vasokonstrikčních a vasodilatačních mechanismů u hypertenze (FGÚ)
10. Délka dne moduluje dílčí části savčích biologických hodin (FGÚ)
11. Aktivace makrofágů potravinovými antigeny (MBÚ)
12. Studium časného vývoje imunitního systému prasat (MBÚ))
13. Translační regulace v průběhu vývoje a zrání pylu (ÚEB)
14. Interakce fytohormonů typu cytokininů a auxinů při řízení vývoje rostlin (ÚEB)
15. Aromatické cytokininy - nová skupina rostlinných cytokininů (ÚEB)
16. Jaderná kompartmentalizace prekursorických mRNA: Pohyb uvolněných transkriptů do jaderných skvrn (ÚEM)
17. Difúzní parametry mozku a míchy během patologických stavů (ÚEM)
18. Přechodové stavy při aktivaci protinádorového léčiva cisplatiny (ÚMBR)
19. Sérologická variabilita evropských izolátů viru mozaiky ředkvičky (ÚMBR)
20. Fosfoprotein asociovaný s mikrodoménami obohacenými o glykosfingolipidy (PAG), nový obecně exprimovaný transmembranový adaptorový protein, se váže na protein tyrozin kinázu Csk a účastní se regulace aktivace T buněk (ÚMG)
21. Klonování a charakterizace str operonu a exprese elongačního faktoru Tu z Bacillus stearothermophilus (ÚMG)
22. Využití monoklonálních protilátek proti proteinům lidských spermií k diagnostice patologie spermií a výběru vhodné metody fertilizace v asistované reprodukci (ÚMG)
23. Devitalizační technika jako nový postup při léčbě zhoubných nádorů (ÚŽFG)
24. Zkrácené analogy lidského inzulínu (ÚŽFG)

5.1. Struktura chromatinu vyššího řádu a její funkční důsledky

Stanislav Kozubek

V BFÚ byly vyvinuty cytometry s vysokým rozlišením (standardní a konfokální), které umožnily zjistit dvoj- a trojrozměrné rozložení řady genetických lokusů v jádrech buněk odvozených z lidské krve a střevního epitelu. Bylo prokázáno, že genetické elementy (geny, centromery, chromozomy) se nacházejí ve sférických hladinách v určité vzdálenosti od středu jádra, která je pro daný element charakteristická. Distribuce genů uvnitř sférických hladin je náhodná. Existují výrazně polární typy chromozomů (s heterochromatickou částí u membrány a euchromatickou částí blíže středu jádra), zatímco u jiných chromozomů se nepodařilo polaritu prokázat. Pořadí sférických hladin pro jednotlivé genetické elementy a stejně tak polarita chromozomů se do značné míry zachovávají v průběhu buněčného cyklu, při diferenciaci a v průběhu reparace po ozáření. V trisomických buňkách, u nichž se v jádře vyskytuje i třetí kopie některého chromozomu, se genetické elementy nacházejí ve stejných sférických hladinách jako u dvou odpovídajících homologů v normálním diploidním jádře. Bylo zjištěno, že poloha chromozomu v buněčném jádře závisí na obsahu R-bandů, tj. oblastí, které mohou být exprimovány. Chromozomy s větším obsahem R-bandů se nacházejí blíže ke středu jádra. Diferenciace vede ke kondenzaci značné části chromatinu a k jeho přesunu k periférii jádra. Dědičný útlum exprese určitých genů je tedy pravděpodobně spojen se změnou jejich polohy a posunutím do oblasti heterochromatinu. Byla nalezena vazba mezi určitými genetickými elementy v jádře buňky, jejímž důsledkem je zvýšená pravděpodobnost indukce chromozomových aberací po ozáření a zvýšená četnost vzniku zhoubných onemocnění.

• Bártová, E., Kozubek, S., Kozubek, M., Jirsová, P., Lukášová, E., Skalníková, M., Buchníčková, K.: The influence of the cell cycle, differentiation and irradiation on the nuclear location of the abl, bcr and c-myc genes in human leukemic cells. - Leukemia Res. 24: 233-241 (2000).
• Bártová, E., Kozubek, S., Kozubek, M., Jirsová, P., Lukášová, E., Skalníková, M., Cafourková, A., Koutná, I.: Nuclear topography of the c-myc gene in human leukemic cells. - Gene 244: 1-11 (2000).
• Kozubek, S., Lukášová, E., Amrichová, J., Kozubek, M., Lišková, A., Šlotová, J.: Influence of cell fixation on chromatin topography. - Anal. Biochem. 282: 29-38 (2000).
• Skalníková, M., Kozubek, S., Bártová, E., Lukášová, E., Jirsová, P., Cafourková, A., Kozubek, M., Koutná, I.: Fine structure of higher-order compartments of chromosome territories in human cell nuclei. - Chromosome Res. 8: 487-499 (2000).
• Jirsová, P., Bártová, E., Kozubek, S., Kozubek, M., Lukášová, E., Cafourková, A., Koutná, I., Skalníková, M.: Nuclear distribution of the centromeric heterochromatin and the p53 gene of human leukemic cell lines after irradiation. - Radiat. Res. 155: 69-77 (2000).

5.2.  Mutační analýza chromozomálního proteinu HMG-1

Michal Štros

HMG-1 je chromozomální protein, který je nezbytný pro replikaci, transkripci, rekombinaci a reparaci DNA. HMG-1 se specificky váže k deformované a ohnuté DNA (např. DNA modifikovaná protinádorovým léčivem cisplatinou, palidromy a křížové struktury DNA). Metodou mutační analýzy byl v BFÚ prokázán význam bazických aminokyselin N-terminální oblasti a helixu I centrální domény proteinu HMG-1 (domény B) pro vazbu s křížovými strukturami DNA a deformaci DNA vlivem tvorby nadšroubovicového vinutí. Dále byla prokázána funkce aminokyseliny fenylalaninu helixu I (poloha 103) pro vznik nadšrou-bovicového vinutí v DNA (za přítomnosti enzymu topoizomeráza I). Získané výsledky umožnily předložit model účasti individuálních aminokyselin domény B při indukci nadšroubovicového vinutí v DNA. Dosažené výsledky přispívají k objasnění funkce HMG-1 proteinu jako "DNA chaperonu" při tvorbě komplexních nukleoproteinových struktur.

• Štros, M., Muselíková, E.: A Role of Basic Residues and the Putative Intercalating Phenylalanine of the HMG1-Box B in DNA Supercoiling and Binding to Four-way DNA Junctions. - J. Biol. Chem. 275: 35699-35707 (2000). IF=7.9

5.3. Modulace účinků látek navozujících diferenciaci a apoptózu lidských nádorových buněk

Alois Kozubík

V pokusech in vitro bylo prokázáno, že 1) po kombinovaném působení butyrátu (vznikajícího fermentací vlákniny ve střevě a navozujícího diferenciaci) a nádory nekrotizujícího faktoru a (TNF-a) dochází u buněk odvozených z adenokarcinomu kolonu ke koncentračně závislému posílení apoptózy, ale na druhé straně k potlačení diferenciace, 2) inhibice cytochromu P-450 u leukemických buněk synergicky zvyšuje antiproliferační a diferenciační účinky kyseliny all-trans retinové (ATRA), zvyšuje viabilitu a zabraňuje apoptóze indukované ATRA udržováním zvýšené hladiny protiapopticky působícího proteinu Bcl-2. Vzhledem k tomu, že studované látky jsou již klinicky používány, mohou mít výsledky praktický význam v protinádorové strategii využívající kombinovanou terapii, jejímž cílem je zvýšení účinnosti a snížení vedlejších účinků léčby.

• Kovaříková, M., Pacherník, J., Hofmanová, J., Zadák, Z., Kozubík, A.: TNF-a modulates the differentiation induced by butyrate in the HT-29 human colon adenocarcinoma cell line. - European Journal of Cancer 36: 1844-1852 (2000). IF=2.743
• Hofmanová J., Souček K, Dušek L., Netíková J., Kozubík A.: Inhibition of cytochrome P?450 modulates all-trans-retinoic acid-induced differentiation and apoptosis of HL-60 cells. - Cancer Detection and Prevention 24(4): 325-342 (2000). IF=0.690

5.4. Svlékání hmyzu a hlístic má společný regulátor: jaderný receptor Ftz-f1

Podobně jako u hmyzu, vyžaduje růst hlístic (Nematoda) periodickou obměnu kutikuly (svlékání). Členovci a Nematoda byli na základě molekulárních dat společně vřazeni mezi "svlékající se" živočichy (kmen Ecdysozoa), avšak funkční srovnání procesu jejich svlékání chybí. U hmyzu jsou svlékání a metamorfóza řízeny steroidními signály (ekdysteroidy). Ty přes komplex dvou jaderných receptorů (EcR a Usp) aktivují kaskádu transkripčních faktorů, vedoucí až k regulaci genů zodpovědných za stavbu kutikuly. U nematoda Caenorhabditis elegans je svlékání závislé na cholesterolu, avšak o molekulární podstatě působení steroidů nevíme nic. Je záhadou, proč u tohoto jednoduchého organismu nacházíme přes 250 genů pro jaderné receptory (pětkrát více než u člověka). Přitom ortology EcR a Usp, jediné známé receptory se schopností převádět ekdysteroidní signál na genovou expresi, u C. elegans chybí.

Jedním z evolučně nejstarších jaderných receptorů, který je konservován též u C. elegans, je transkripční faktor Ftz-F1. Ftz-F1 je klíčovým článkem ekdysteroidní signální dráhy u hmyzu; u drosofily je vedle svlékání a metamorfózy nezbytný pro segmentaci embrya. U savců řídí ortology Ftz-F1 diferenciaci gonád a syntézu steroidních hormonů. Abychom zjistili funkci Ftz-F1 u C. elegans, připravili jsme mutantní linie a rovněž jsme pomocí interference RNA zablokovali postembryonální expresi Ftz-F1. Zjistili jsme, že delece genu Ftz-F1 vede k zastavení embryogenese a prokázali jsme úlohu faktoru Ftz-F1 ve svlékání a diferenciaci gonád a vulvy. Všechny defekty jsou v souladu s expresním profilem Ftz-F1 v hypodermis a gonádách. Výsledky ukazují, že svlékání je společnou funkcí Ftz-F1 u hmyzu a nematodů, což podporuje hypotézu o monofyletickém původu svlékání.

• Asahina, M., Ishihara, T., Jindra, M., Kohara, Y., Katsura, I. & Hirose, S. (2000) The conserved nuclear receptor Ftz-F1 is required for embryogenesis, molting and reproduction in Caenorhabditis elegans. Genes Cells 5: 711-723.

5.5. Biodiverzita vodního hmyzu jako ukazatel stavu životního prostředí

Pro posouzení stavu horských refugií ohrožených druhů (Krkonoše, Šumava, Jeseníky) a biosferických rezervací (Křivoklátsko) byly využity především jepice. V Jeseníkách jich bylo nalezeno 38 druhů (40.4 % jepic ČR), z toho dva nové pro republiku (Zahrádková et al. 1999), v Krkonoších 31 druhů a na Křivoklátsku 37 druhů. Další nový druh pro celé uzemí se našel v Bílých Karpatech. Z hlediska ochrany biodiverzity byly rovněž shrnuty poznatky o všech druzích vážek ČR. Knižní monografie o vážkách obsahuje i určovací klíč a přehled hlavních taxocenóz (Hanel & Zelený, 2001). Obdobně pojatá revize chrostíků České a Slovenské republiky (Chvojka & Novák, 2001) vedla k vyřazení řady druhů, na druhé straně jich bylo několik pro ČR nově nalezeno - celkový počet zahrnuje 248 druhů. Byl rovněž zpracován bioindikační význam několika skupin vodních ploštic (Papáček, 2000). Pro posouzení dlouhodobých trendů v čistotě vod má zásadní význam studie jepic, pošvatek a chrostíků na třech lokalitách řeky Křemelné na Šumavě. V létech 1955-1999 zde bylo celkem odebráno a určeno přes 10 000 jedinců a výsledky zpracovány specielními počítačovými programy. S výjimkou padesátých let, kdy došlo k výraznému snížení biodiverzity v důsledku značných zásahů do morfologie toku, se společenstva všech tří skupin vodního hmyzu dlouhodobě přibližovala stavu, jaký zde podle dostupných údajů panoval před válkou. K obnově společenstev, která lze považovat za přirozená, došlo během posledních 5-10 let. Přes určitý pokles zastoupených taxonů v sedmdesátých a osmdesátých létech není jejich výměna diky relativní stabilitě studovaných biotopů u žádné ze sledovaných skupin příliš výrazná a není statisticky významně korelována s procesem acidifikace toků (Soldán, 1999, Soldán et al. 2001).

• Hanel L. & Zelený J, 2001: Vážky (Odonata), výzkum a ochrana. Metodika ČSOP č. 9. Reg. Centrum ČSOP pro střední Čechy, Vlašim, 248 str. rukopisu (v tisku).
• Chvojka & Novák, 2001: Additions and corrections to the checklist of Trichoptera (Insecta) from the Czech and Slovak Republic. Acta Mus. Nat. Pragae, Series B, Historia Naturalis, 56: 39 str. rukopisu (v tisku)
• Papáček M., 2000: Chapter 24: Small Aquatic Bugs (Nepomorpha) with Slight or Underestimated Economic Importance. In: Schaefer W.P. & Panizzi A.R. (Eds): Heteroptera of Economic Importance. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C., pp. 591-600.
• Soldán T., (1999) Aquatic insects communities and revitalization of the Křemelná river: Conceptional and methodical approach to the project. In: Zelenková E. (Ed.) Revitalizace vodních ekosystémů. Správa NP a CHKO Šumava, Vimperk, pp. 73-80.
• Soldán T., Zahrádková S. & Putz M., 2001: Long-term changes of biodiversity of aquatic insects (Ephemeroptera, Plecoptera, Trichoptera) in a regulated segment of the Křemelná River Basin (Šumava Mts., Czech Republic), Regulated rivers (submitted).
• Zahrádková S., Soldán T. & Mergl A. (1999) Mayflies (Ephemeroptera) of the Jeseníky Mountains Protected Landscape Area, Czech Republic: A historical and present status overview. Scripta Fac. Sci. Nat. Univ. Masaryk. Brun., 24: 67-97.

5.6. Entomopatogenní hlístice, jejich rozšíření a význam pro regulaci hmyzích škůdců

Hlístice napadající hmyz významně snižují populace některých škůdců, kteří aspoň část svého vývoje prodělávají v půdě. Výskyt hlístic je ovlivňován řadou faktorů, především množstvím a vhodností hostitelů. Půdní vzorky odebrané na lokalitách s agregací hostitelů obsahovaly hlístice v 70% případů. Na území ČR bylo nalezeno 7 druhů hlístic, ze kterých steinernema kraussei převládá na lokalitách ploskohřbetek a s. feltiae v agregacích píďalek podzimních (Mráček, 2000; Mráček & Bečvář, 2000; Mráček et al., 2000). Allopatrické populace této hlístice, jež byla dosud známá jen z Evropy, byly prokázány ve vzorcích z USA a Kanady (Stock et al., 2000). Unikátní případ epizootie nákazy druhem s. intermedium byl zaznamenán v severním Německu, kde v populaci muchnice bibio marci způsobila parazitace hlísticí 90% úmrtnost larev a kukel (Mráček & Sturhan, 2000). Srovnávaní úspěšnosti izolace hlístic jejich přímou extrakcí z půdy a jejich lákáním do hmyzích návnad (tzv. galeriových pastí) ukázalo značné rozdíly mezi těmito metodikami. v jednom půdním vzorku se mohou vyskytovat 2 až 3 druhy hlístovek, které odhalí přímá extrakce, zatímco galeriová past zachytí obvykle jen jeden druh, ten který je v daných podmínkách nejagresivnější. Přímá extrakce také mnohem přesněji určí množství invazních larev v půdním vzorku, naproti tomu nevyjeví nic o invaznosti druhů a znesnadňuje založení živé laboratorní kultury, což obé umožňuje použití galeriových pastí (Sturhan & Mráček, 2000). Jen kombinace obou metod umožňuje poznání vztahů mezi hlísticemi a jejich hostiteli. Tyto znalosti jsou nezbytné pro efektivní použití hlístic proti škůdcům.

• Stock P., Mráček Z. & Webster J.M. (2000): Morphological variation among allopatric populations of Steinernema kraussei (Steiner, 1923) (Rhabditida: Steinernematidae). Nematology 2: 143-152.
• Mráček Z. & Bečvář S. (2000): Insect aggregations and entomopathogenic nematodes occurrence. Nematology 2: 297-301.
• Mráček Z. & Sturhan D. (2000): Epizootic of the entomopathogenic nematode, Steinernema intermedium (Poinar) in a nest of the bibionid fly, Bibio marci (L). J.Invertebr.Pathol. 76: 149-150.
• Sturhan D. & Mráček Z. Comparison of the Galleria baiting technique and a direct extraction method for recovering Steinernema infective-stage juveniles from soil. Folia Parasitol. 47: 315-318.
• Mráček Z., Bečvář S., Kindlmann P. (2000): Do insect aggregations influence entomopatho-genic nematodes occurrence? In: Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes, P.H. Smits (ed).7th European Meeting, Wienna 22-26 March, 1999, IOBC WPRS Bulletin, 23: 123-128.
• Mráček Z. (2000): Entomopathogenic Nematode Occurrences and their Dependence on Insect Aggregations. Proc. 9th Helminth. Days, Dolní Věstonice, Czech Republic, June 5-8, 2000, Helminthologia 37: 185.

5.7. Výzkum účasti nově popsaných typů 5-HT receptorů v mechanismu neuroimunofarmakologických účinků muramylpeptidů

J. Ševčík

Naše práce navazuje na původní poznatky získané již dříve na našem ústavu, totiž že imunomodulátory z řady muramylpeptidů mají vlastní neurofarmakologické účinky, zprostředkované ovlivněním serotonergního (5-HT) nervového systému. Současný projekt, jehož cílem bylo a je zkoumání interakce mezi těmito imunomodulátory a 5-HT nervovým systémem, tyto výsledky rozšiřuje. Již dříve jsme sledovali účinek modelové látky muramyldipeptidu (MDP) na serotonergní systém zažívacího traktu s přihlédnutím k typu zúčastněného 5-HT receptoru. V tomto roce jsme se zabývali možnou interakcí MDP s 5-HT_1A subtypem. Pokračuje tak mapování účinků MDP na jednotlivých 5-HT subtypech, kterých je dnes známo čtrnáct. Většinu z nich lze na modelových preparátech zažívacího traktu zkoumat snadno a bez větších potíží. Naše zjištění tak přinášejí nový pohled na působení muramylpeptidů v serotonergním systému, které může mít důležité důsledky, neboť 5-HT systém je velmi významným prostředníkem mnoha fyziologických funkcí organismu. Mapování tohoto působení na jednotlivých 5-HT subtypech by tak mohlo přispět ke konstrukci nových typů imunomodulátorů zbavených nežádoucích účinků, anebo i ke vzniku nové třídy neurofarmakologicky aktivních látek. Protože se podařilo některé z typů 5-HT receptorů prokázat i na samotných imunokompetentních buňkách, mohou mít tyto poznatky význam i pro vysvětlení vlastních imunofarmakologických účinků MDP.

5.8. Význam mitochondrií pro kontrolu množství tukové tkáně

Významného pokroku bylo dosaženo při studiu mechanizmů, které řídí obsah tuku v těle. Výzkum vychází z poznatků o hnědé tukové tkáni, která ovlivňuje celkovou energetickou bilanci (a tělesnou hmotnost) tím, že většinu energie z oxidace substrátů uvolňuje formou tepla. Teplo vzniká v mitochondriích částečným "odpřažením" oxidace substrátů od syntézy ATP účinkem "odpřahujícího proteinu 1" (uncoupling protein 1; UCP1). Podobné bílkoviny (UCP2 - UCP5) jsou přítomné i v dalších tkáních. Genetické studie naznačují, že UCP2 v bílé tukové tkáni brání hromadění této tkáně a rozvoji obezity. Protože bílá tuková tkáň obsahuje poměrně málo mitochondrií, není pravděpodobné, že podkladem anti-obezitního účinku UCP2 je stimulace tvorby tepla. Pokusy na buněčných kulturách a transgenních myších ve Fyziologickém ústavu prokázaly, že v bílé tukové tkáni vede "odpřažení" k útlumu syntézy mastných kyselin. Je pravděpodobné, že účinek UCP2 na tvorbu mastných kyselin v tukové buňce je jedním ze základních mechanismů, které určují ukládání tuku v těle. Tento nález je významný nejen pro pochopení funkce UCP, ale i pro strategii nových léčebných postupů zaměřených na snižování nadváhy.

• Rossmeisl, M., Syrový, I., Baumruk, F., Flachs, P., Janovská, P., Kopecký, J.: Decreased fatty acid synthesis due to mitochondrial uncoupling in adipose tissue. - FASEB J. 14: 1793-1800 (2000).

5.9. Poruchy rovnováhy vasokonstrikčních a vasodilatačních mechanismů u hypertenze

Zvýšený tonus hypertrofických odporových arteriol je základní charakteristikou všech forem lidské i experimentální hypertenze. Metodou postupné blokády jednotlivých vasoaktivních systémů lze studovat poruchy rovnováhy vasokonstrikčních a vasodilatačních systémů při udržování vysokého krevního tlaku u bdělých potkanů se solnou resp. spontánní hypertenzí. U Dahlových sůl-sensitivních i hereditárně hypertriglyceridemických potkanů převažuje vasokonstrikční vliv sympatické hyperaktivity nad vasodilatačním působením oxidu dusnatého (NO), což bylo potvrzeno také v souborech F2 hybridů odvozených od rodičovských hypertenzních a normotenzních kmenů. Příčinou relativního deficitu hlavního vasodilatačního systému není snížená tvorba NO ale jeho urychlená degradace vlivem interakce NO se superoxidovými anionty. Akutní podání tempolu, látky snižující množství superoxidových aniontů v buňce, skutečně vede k významnému poklesu krevního tlaku a k potenciaci vasodilační aktivity oxidu dusnatého. Výsledky našich studií ukazují na důležitost vasodilatačních a tím i antihypertenzivních účinků oxidu dusnatého, které mohou být podporovány podáváním vhodných látek urychlujících odbourávání superoxidových aniontů, jejichž tvorba v tkáních kardiovaskulárního aparátu je zvýšená za různých patologických stavů.

• Zicha, J., Dobešová, Z., Kuneš, J.: Relative deficiency of nitric oxide-dependent vasodilation in salt-hypertensive Dahl rats: the possible role of superoxide anions. J. Hypertens. 19:1-8 (2001).

5.10. Délka dne moduluje dílčí části savčích biologických hodin

Biologické hodiny řídící denní časový program savců jsou uloženy ve dvou shlucích nervových buněk v mozku nazývaných suprachiasmatická jádra. Jádra se skládají ze dvou částí, a to ventrolaterální a dorsomediální. Již dříve jsme u potkanů prokázali, že funkce ventrolaterální části, která je nervy spojena přímo s oční sítnicí, je modulována délkou dne. Otázkou zůstalo, zda délka dne ovlivňuje i funkci dorsomediální části, která toto přímé spojení nemá. Pro dorsomediální část je typická denní rytmicita v zapínání a vypínání genu c-fos, která naznačuje vyšší a nižší nervovou aktivitu, i denní rytmicita v zapínání genu pro vasopresin, která je řízena geny zodpovědnými za chod hodin. Byli-li potkani chováni na dlouhých "letních" dnech, byly geny pro c-fos i pro vasopresin zapnuty po delší část dne než byli-li chováni na krátkých "zimních" dnech. Zdá se tedy, že délka dne moduluje funkci nejen ventrolaterální, ale i dorsomediální části suprachiasmatického jádra a že tudíž biologické hodiny jako celek řídí nejen denní, ale i roční řád savčího organismu.

• Sumová, A., Trávníčková, Z., Illnerová, H.: Spontaneous c-Fos rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus: location and effect of photoperiod. Am.J.Physiol. (Regulatory Integrative Comp.Physiol.) 279:R 2262-2269 (2000).
• Jáč, M., Sumová, A., Illnerová, H.: c-Fos rhythm in subdivisions of the rat suprachiasmatic nucleus under artificial and natural photoperiods. Am.J.Phyisol. (Regulatory Integrative Comp.Physiol.) 279:R 2270-R2276 (2000)
• Jáč, M., Kiss, A., Sumová, A. Illnerová, H., Ježová, D.: Daily profiles of arginine vasopressin mRNA in the suprachiasmatic, supraoptic and paraventricular nuclei of the rat hypothalamus under various photoperiods. Brain Res. 887:472 - 476 (2000)

5.11. Aktivace makrofágů potravinovými antigeny Celiakie je závažné chronické onemocnění tenkého střeva, které je vyvoláno lepkem (glutenem) obsaženým v pšenici a příbuzných obilovinách. U geneticky vnímavých jedinců působí potrava obsahující lepek poškození střevní tkáně (zmenšuje plochu střeva a snižuje vstřebávání živin a minerálů). Vedle zažívacích potíží může být celiakie spojena i s onemocněním nervového, svalového nebo endokrinního systému.

V počátečním stádiu nemoci dochází ve sliznici tenkého střeva k nárůstu počtu buněk obranného imunitního systému a k jejich aktivaci. Bylo zjištěno, že výjimečná složka potravy jakou je pšeničný gluten ovlivňuje vedle buněk specifické obrany (lymfocytů) i aktivitu buněk přirozené imunity, makrofágů. Gluten a jeho štěpy (vytvářené v průběhu trávení), na rozdíl od jiných bílkovin potravy (jako jsou sojový protein, kasein a ovalbumin), působí přímo na makrofágy a vyvolávají v nich zvýšenou produkci cytokinů (TNF-a a IL-10) a v přítomnosti cytokinu IFN-g (typického pro celiakii) i produkci aktivních radikálů oxidu dusnatého, molekul spojených s regulací imunity a místním poškozením tkáně. Nejúčinněji působily štěpy glutenu vytvářené působením enzymu pepsinu (působícího v kyselém prostředí žaludku). Aktivace buněk byla sledována metodami imunochemickými i genetickými. Dlouhodobé zvýšení hladin cytokinů (IFN-g a TNF-a) a následný nárůst hladiny aktivních radikálů oxidu dusnatého, ke kterému dochází ve střevní tkáni pacientů, patří mezi mechanizmy, které se mohou podílet na vzniku a průběhu celiakie.

• Tučková, L., Tlaskalová-Hogenová, H., Flegelová, Z., Zídek, Z.: Activation of macrophages by food antigens: enhancing effect of gluten on nitric oxide and cytokine production. - J. Leukoc. Biol. 67: 312-318 (2000).

5.12.  Studium časného vývoje imunitního systému prasat

Provedli jsme rozsáhlou analýzu leukocytárních populací během prenatálního a časného postnatálního vývoje prasat. Dokázali jsme přítomnost nejčasnějších leukocytů ve žloutkovém vaku a ukázali jsme, že fetální játra jsou prvním a kostní dřeň konečným a zároveň nejmohutnějším zdrojem B lymfocytů. Detailní studium thymocytárních populací nám umožnilo popsat časný vývoj T buněk prasat jako experimentálního modelu. Dokázali jsme existenci kolonizačních vln, ve kterých přicházejí časné prekurzory (pro-T buňky) do fetálního základu thymu. Další výsledky týkající se vývoje nejčasnějších prekurzorů v embryonálním těle a původu a klasifikace B lymfocytů jsou přijaty k publikování ve Veterinary Immunology and Immunopathology.

K určení složek normální střevní mikroflóry, které hrají významnou úlohu při aktivaci slizniční imunity, využíváme s výhodou modelu gnotobiotických bezkolostrálních selat. Experimentální přístup spočívá v získání bezmikrobních selat, která jsou kolonizována vybranými mikroorganizmy nebo jejich směsí. Interakce vybraného mikroba s imunitním systémem je sledována kvantifikací humorálních faktorů (protilátek) a buněčných populací (CD2+ a CD2- B lymfocytů a CD4+CD8+ T lymfocytů), případně i zastoupením buněk produkujících imunoglobuliny. Takto se podařilo rozlišit kmeny E. coli, které mají možné vakcinační a probiotické účinky. Dále byl potvrzen význam anaerobní flóry pro vývoj střevní imunity. Jsou vyhledávány nejaktivnější komponenty mikroflóry s cílem nalézt vhodné nepatogenní mikroorganizmy schopné zvyšovat kolonizační rezistenci a slizniční imunitu vůči potenciálním patogenům.

• Šinkora M., Šinkora J., Řeháková Z., Butler J.E., Early ontogeny of thymocytes in pigs: Sequential colonization of the thymus by T cell progenitors. Journal of Immunology 165, 1832-1839, 2000.

5.13. Translační regulace v průběhu vývoje a zrání pylu

Věra Čapková, David Honys

Klíčení pylu začíná rehydratací pylového zrna a zahrnuje aktivaci metabolických procesů nezbytných pro rychlý růst pylové láčky. Zajištění tohoto doslova explosivního růstu vyžaduje najednou obrovské množství informační (mediátorové) RNA (mRNA) i bílkovin, z nichž část je skladována v nezralém pylu, ale část musí být syntetizována až během růstu láčky. Klíčení pylových zrn mnoha rostlinných druhů je často nezávislé na přepisu DNA (transkripci), ale životně závislé na přepisu mRNA do bílkovin (translaci). Právě tato skutečnost ukazuje na klíčovou úlohu zásobní mRNA syntetizované ve zrajícím pylu a skladované pro pozdější použití, pro translaci v rostoucí pylové láčce.

Translačně neaktivní mRNA byly v různých živočišných i rostlinných systémech opakovaně nalezeny v asociaci s bílkovinami ve formě tzv. mediátorových ribonukleoproteinových částic (mRNP). Potlačení translace zásobních mRNA v nezralém pylu bylo před několika lety na našem pracovišti prokázáno, ovšem důkaz přítomnosti skladované mRNA ve vyvíjejícím se pylu ve formě zásobních mRNP chyběl.

S využitím námi nově vypracovaných metod izolace buněčných částic doplněných o standardní postupy molekulární biologie se podařilo ukázat, že zásobní mRNA syntetizovaná během vývoje a zrání pylu je ukládána ve formě volných mediátorových ribonukleoproteinových částic. Při studiu pylově specifického genu ntp303, jehož výrazný výskyt a prokázané plné potlačení jeho translace jej činí pro výzkum translační regulace mimořádně vhodným, byla nalezena nová forma existence skladované mRNA v nezralém pylu, a to forma částic EPP. EPP částice byly definovány jako ribonukleoproteinové komplexy obsahující translatovatelnou, ale t.č. translačně neaktivní mRNA, které se od volných mRNP liší jednak svou velikostí a jednak skladbou bílkovinné složky.

Publikace:

• Honys D., Combe J. P., Twell D., Čapková V.: The translationally repressed pollen-specific ntp303 mRNA is stored in non-polysomal mRNPs during pollen maturation. Sex. Plant Reprod. 13: 135-144, 2000.
• Honys D., Čapková V.: Temporal changes in the RNA distribution between polysomes and postpolysomal ribonucleoprotein particles in tobacco male gametophyte. Biol. Plant. 43(4): 517-522, 2000.
• Mašek T., Smýkal P., Janotová I., Honys D., Čapková V., Pechan P. M.: Isolation of a Brassica napus L. cDNA encoding a putative high-mobility-group HMG I/Y protein. Plant Sci. 159: 197-204, 2000.
• Wittink F. R. A., Knuiman B., Derksen J., Čapková V., Twell D., Schrauwen J. A. M., Wullems G. J.: The pollen-specific gene ntp303 encodes a 69 kD glycoprotein associated with the vegertative membranes and the cell wall. Sex. Plant Reprod. 12: 276-284, 2000.

5.14. Interakce fytohormonů typu cytokininů a auxinů při řízení vývoje rostlin

Miroslav Kamínek a kol.

Základní růstové a vývojové procesy rostlin založené na regulaci dělení a diferenciace buněk jsou hormonálně řízeny. Uplatňují se zde zejména dvě skupiny fytohormonů, auxiny a cytokininy. O jejich výsledném účinku rozhoduje jejich vzájemná koncentrace a intenzita přenosu jimi nesených signálů. Byl vypracován model metabolické regulace hladin cytokininů a jejich poměru k auxinům, založený na autoindukci akumulace cytokininů v citlivých buňkách, indukci odbourávání cytokininů substrátem a na jejich inaktivaci glykosylací. Model objasňuje mechanismy navození dočasné hormonální nerovnováhy vedoucí k indukci specifických morfogenních procesů (diferenciace různých orgánů) a k následnému ustavení hormonální rovnováhy (homeostáze) potřebné k dokončení vývoje iniciovaných struktur. Jeho platnost byla ověřena v pokusech s kulturami rostlinných buněk a pletiv in vitro a s intaktními rostlinami tabáku, petunie a pšenice. Pokusy s mutanty huseníčku (Arabidopsis) potvrdily, že změny fenotypu odrážejí změny poměrných koncentrací auxinů a cytokininů, aktivity cytokininoxidázy a exprese genů zapojených do přenosu cytokininového signálu.

Publikace:

• Frank M., Rupp H.-M., Prinsen E., Motyka V., Van Onckelen H., Schmülling T.: Hormone autotrophic growth and differentiation identifies mutant lines of Arabidopsis with altered cytokinin and auxin content or signaling. Plant Physiol. 122: 721-730, 2000.
• Auer C.A., Motyka V., Březinová A., Kamínek M.: Endogenous cytokinin accumulation and cytokinin oxidase activity during shoot organogenesis of Petunia hybrida. Physiol. Plant. 105: 141-147, 1999.
• Kamínek M., Motyka V., Vaňková R.: Regulation of cytokinin content in plant cells.
  Physiol. Plant. 101: 689-700, 1997.
• Prinsen E., Kamínek M., Van Onckelen H. A.: Cytokinin biosynthesis: a black box?
  Plant Growth Regul. 23: 3-15, 1997.
• Redig P., Motyka V., van Onckelen H., Kamínek M.: Regulation of cytokinin oxidase activity in tobacco callus expressing the T-DNA ipt gene. Physiol. Plant. 99: 89-96, 1997.
• Vaňková R.: Cytokinin glycoconjugates - distribution, metabolism and function. In: Strnad. M., Peč, P. and Beck, E.: Advances in Regulation of Plant Growth and Development, pp. 67-78, Peres Publishers, Prague, 1999.
• Vaňková R., Gaudinová A., Süssenbeková H., Dobrev P., Strnad M., Holík J., Lenfeld J.: Comparison of oriented and random antibody immobilization in immunoaffinity chromatography of cytokinins. J. Chromatography A811: 77-84, 1998.
• Zažímalová E., Březinová A., Motyka V., Kamínek M.: Control of cytokinin biosynthesis and metabolism. In: Libbenga, K.R., Hall, M.A., Hooykaas, P., eds.: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Ser. New Comprehensive Biochemistry, Elsevier, 141-160, 1999.

5.15. Aromatické cytokininy - nová skupina rostlinných cytokininů

Miroslav Strnad a kol.

Netradičními analytickými postupy založenými na kombinaci protilátkové specifity vůči jednotlivým analogům 6-benzylaminopurinu (BAP) a kapalné chromatografie se podařilo detekovat v rostlinných pletivech některé deriváty BAP, tzv. aromatické cytokininy (ARCK) (dosud známé cytokininy - jedna ze skupin rostlinných hormonů - mají isoprenoidní postranní řetězec). Imunoaktivní látky cytokininové povahy byly izolovány a identifikovány plynovou chromatografií-hmotovou spektrometrií. Pro tyto růstové regulátory byl podle rostliny, ze které byly izolovány, navržen český název topoliny. Hlavním a zároveň nejaktivnějším zástupcem této skupiny cytokininů je meta-topolin (mT), který je stejně aktivní jako dosud nejaktivnější přirozeně se vyskytující cytokinin zeatin. Meta-topolin je první látka růstově-regulační povahy objevená v ČR. Objev mT není pouze významným přínosem teoretickým, ale má již i praktické využití v zemědělství, zejména v rostlinných biotechnologiích. Jde o látku vysoce biologicky aktivní v in vitro kulturách, ve kterých vykazuje u některých druhů i 10 krát vyšší morfogenní aktivitu ve srovnání s tradičně používaným BAP. Důvodem je odlišný metabolismus mT a BAP. Důsledkem toho je nejen následné snazší zakořeňování prýtů a jejich minimální poškození, ale i velmi pozitivní účinky při aklimatizaci mikrorostlin při přenosu ze sterilních in vitro podmínek do skleníku.

Publikace:

• Kraigher H., Strnad M., Hanke D.E., Batič F.: Cytokinin content in needles of Norway spruce (Picea abies/L./ Karst.) inoculated with two strains of the ectomycorrhizal fungus Thelephora terrestris (Ehrh.) Fr. Forstw. Cbl. 112: 107-111, 1993.
• Jones L.H., Martínková H., Strnad M., Hanke D.: Occurrence of aromatic cytokinins in oil palm. J. Plant Growth Regul. 15: 39-49, 1996.
• Strnad M.: Enzyme immunoassay for N ⁶-benzyladenine and N ⁶-(3-hydroxybenzyl)-adenine cytokinins. J. Plant Growth Regul. 15:179-188, 1996.
• Werbrouck S.P.O., Strnad M., Van Onckelen H.A., Debergh P.C.: Meta-topolin, an alternative to benzyladenine in tissue culture? Physiol. Plant. 98: 291-297, 1996.
• Strnad M.: The aromatic cytokinins. Physiol. Plant. 101: 674-688, 1997.
• Strnad M., Hanuš J., Vaněk T., Kamínek M., Hanke D.E.: Meta-Topolin, a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus x canadensis Moench., cv. Robusta). Phytochemistry 45: 213-218, 1997.
• Trávníček Z., Marek J., Doležal K., Strnad M.: The structure of 6-(2-hydroxybenzylamino)purine acetic acid solvate. Z. Kristallogr. 212: 538-541, 1997.
• Galuszka P., Šebela M., Luhová, L., Zajoncová L., Frébort I., Strnad M., Peč P.: Cytokinins as inhibitors of copper amine oxidase. J. Enz. Inhib. 13: 457-463, 1998.
• Holub J., Hanuš J., Hanke D.E., Strnad M.: Biological activity of cytokinins derived from ortho- and meta-hydroxybenzyladenine. Plant. Growth Regul. 26: 109-115, 1998.
• Baroja-Fernandez E., Aguirreolea J., Martínková H., Hanuš J., Strnad M.: Endogenous cytokinins in two micropropagated potato cultivars in relation to transplanting survival. Physiol. Plant. 2001 (in press)

5.16.  Jaderná kompartmentalizace prekursorických mRNA: Pohyb uvolněných transkriptů do jaderných skvrn

Prof. RNDr. I. Raška, DrSc. vedoucí oddělení buněčné biologie Ústavu experimentální medicíny AV ČR a Laboratoře genové exprese 3. lékařské fakulty UK v Praze.

Buněčné jádro je jistě nejsložitější buněčnou organelou, která obsahuje chromozomální DNA a tudíž prakticky celý genom. Chromozomální DNA je v komplexu s bílkovinami a vytváří nukleoproteinový komplex, zvaný chromatin. Chromatinové struktury jednotlivých chromozomů nejsou navzájem promíchány a vytvářejí uvnitř jádra oddělená, více či méně kompaktní chromozomální teritória. Chromatinové struktury do značné míry zaplňují jádro. Zbývající prostor jádra, v němž chromatin není přítomen nebo je přítomen v zanedbatelné koncentraci, je nazýván interchromatinový prostor. Transkripční aktivity, tj. přepis specifických segmentů DNA (genů) do RNA, jsou lokalizovány na povrch chromozomálních teritórií, přičemž po ukončení syntézy jsou transkripty uvolňovány do interchromatinového prostoru. Jeho omezený prostor zjevně přispívá k lepší ekonomické bilanci buňky tím, že v něm dochází k vytváření multienzymatických komplexů, které pak po nasměrování např. provádějí v místě aktivních genů transkripci, jakož i kontranskripční sestřih mediátorové RNA (mRNA), během kterého jsou ze sekvence prekursorické mRNA vyštěpeny tzv. introny. V interchromatinovém prostoru, kam je možné situovat metabolismus RNA, nacházíme několik "kompartmentů", především jadérko, jehož hlavní úlohou je tvorba ribozomů, a tzv. jaderné skvrny ("nuclear speckles"), které jsou charakterizovány nahromaděním sestřihových faktorů. Přesná funkce jaderných skvrn není známa, víme však, že slouží jako zásobárny sestřihových faktorů, které jsou rekrutovány do míst aktivních genů, nacházejících se v blízkosti jaderných skvrn.

V naší práci jsme ukázali na aktivní roli jaderných skvrn v sestřihu na modelu specifických genů v lidské buňce. Tyto geny, jakož i nascentní mRNA, jsou vůči jaderným skvrnám lokalizovány náhodně. Na rozdíl od nascentní RNA vytváří uvolněná mRNA, která ještě obsahuje introny, jakousi "cestičku", která směřuje od genu do jaderné skvrny. Naše nálezy svědčí o tom, že na rozdíl od základního kotranskripčního sestřihu může být regulovaný (resp. alternativní) sestřih zpomalený, a navíc může být prostorově oddělen od sestřihu probíhajícího během transkripce. V jádře tak dochází k dvojsměrnému pohybu makromolekulárních komplexů mezi geny obsahujícími introny a jadernými skvrnami. V jednom směru se jedná o rekrutaci sestřihových faktorů z jaderných skvrn do transkripčních míst, ve druhém o pohyb uvolněných mRNA z DNA lokusů do jaderných skvrn. Naše výsledky jsou plně v souladu s naší původní hypotézou o odpřažení transkripce a (regulovaného) sestřihu (Melčák a Raška, J Struct Biol 117,189-194,1996).

• Melčák, I., Cermanová, Š., Jirsová, K., Koberna, K., Malínský, J., Raška, I.: Nuclear pre-mRNA compartmentalization: trafficking of released transcripts to splicing factor reservoirs. Mol. Biol. Cell. 11: 497-510 (2000).

5.17. Difúzní parametry mozku a míchy během patologických stavů

Prof.. MUDr. Eva Syková, DrSc., vedoucí oddělení neurověd Ústavu experimentální medicíny AV ČR a Ústavu neurověd 2. lékařské fakulty UK

Heterogenita šedé hmoty mozkové, která je způsobena přítomností difúzních bariér, zásadním způsobem ovlivňuje směr difúze iontů a neuroaktivních látek a přispívá tak k modulaci přenosu signálů. Změny velikosti extracelulárního prostoru (ECP) jsou vyvolány především zvětšováním objemu gliových buněk a jejich výběžků. U astrocytů, které postrádají hlavní složku strukturálních filament, t.j. GFAP, jsme zjistili odlišnou morfologii a membránové vlastnosti za podmínek simulujících patologické děje in vitro. Masivní uvolnění glutamátu, ke kterému dochází během poranění mozku a míchy a dalších patologických stavů, vyvolává změny v objemu extracelulárního prostoru, astrogliózu a s ní související změny difúzních bariér. Tyto změny mohou ovlivňovat nejen zpomalení difúze neuroaktivních látek (včetně polymerních nosičů léčiv), ale ovlivňují extrasynaptický přenos, přesun neuromediátorů mezi synapsemi, tzv. synaptický "cross-talk", komunikaci neuronů s gliovými buňkami, zvyšují neurotoxicitu excitačních aminokyselin, zvl. glutamátu, vedoucí k poškození nervové tkáně a k buněčné smrti. Ke změnám difúzních parametrů ECP dochází i v průběhu dalších patologických stavů, na př. v průběhu hydrocephalu, po poranění mozkové tkáně a v transplantované tkáni, tedy stavech kdy dojde k nárůstu množství difúzních překážek. Nárůst difúzních bariér v transplantované tkáni tak představuje překážku pro difúzi neuropřenašečů z transplantátů do poškozených oblastí mozku. Difúzní parametry ECP v mozkové kůře u lidí jsou obdobné jako v mozkové kůře experimentálních zvířat, v nádorové tkáni (gliomech) byl pozorován větší ECP, který tak může umožňovat migraci nádorových buněk; čím vyšší byl stupeň malignity nádoru, tím větší byl ECP. Tyto nálezy mají základní význam pro diagnostiku i užití specifických léků u mozkových nádorů.

• Syková, E. Chvátal, A.: Glial cells and volume transmission in the CNS. Neurochem. Int. 36: 397-409 (2000).
• Chvátal, A. Syková, E.: Glial influence on neuronal signaling. Prog. Brain. Res. 125: 199-216 (2000).
• Syková, E., Mazel, T., Vargová, L., Voříšek, I., Prokopová, Š.: Extracellular space diffusion and pathological states. Prog. Brain. Res. 125: 155-178 (2000).
• Jansson, A., Lippoldt, A., Mazel, T., Bartfai, T., Ögren, S.-O., Syková, E., Agnati, L.F., Fuxe K. Long distance signalling in volume transmission. Focus on clearance mechanisms. Prog. Brain. Res. 125: 399-413 (2000).
• Prokopová-Kubinová, Š., Syková, E.: Extracellular diffusion parameters in spinal cord and filum terminale of the frog. J. Neurosci. Res. 62: 530-538 (2000).
• Prokopová-Kubinová, Š., Vargová, L., Tao, L., Ulbrich, K., Šubr, V., Syková, E., Nicholson, C. Poly[N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide] polymers diffuse in brain extracellular space with same tortuosity as small molecules. Biophys. J. (V tisku)

5.18. Přechodové stavy při aktivaci protinádorového léčiva cisplatiny

Zdeněk CHVAL a Miroslav ŠÍP

Význam výpočetních metod a molekulárního modelování při vývoji nových účinných léků v poslední době stále roste i díky tomu, že je možné pomocí těchto metod studovat formy s velmi krátkou dobou života nebo vyskytující se ve velmi malých koncentracích. Takovými jsou i transitní stavy molekul, které se nacházejí v chemických reakcích na půli cesty mezi reaktanty a produkty. Citovaná práce jako prvá představuje transitní stavy v reakci aktivace protinádorového léčiva cisplatiny. Cisplatina potřebuje k získání terapeutické účinnosti jeden nebo více aktivačních kroků. Výpočty byly prováděny pomocí ab initio metod. V transitních stavech je platina pentakoordinovaná a má tvar podstatně deformované trigonální bipyramidy. V práci byly sledovány z hlediska geometrie a energetiky dva aktivační kroky. Geometrie transitních stavů v těchto reakcích je klíčovým parametrem pro terapeutický účinek cisplatiny, neboť určuje kromě jiného i její vazebná místa na deoxyribonukleové kyselině.

• Chval, Z., Šíp, M.: Pentacoordinated transition states of cisplatin hydrolysis. - J. Molecular Structure-Theochem. 532: 59-68 (2000).

5.19. Sérologická variabilita evropských izolátů viru mozaiky ředkvičky

Josef Špak a Darina Kubelková

Virus mozaiky ředkvičky (RaMV) je jedním z nejvýznamnějších patogenů brukvovitých rostlin. Na rozsáhlé sbírce izolátů z řady hostitelských rostlin (hořčice, ozimá řepice, lnička setá, čínské zelí) pocházejících z České republiky, Ruska a Itálie byla studována sérologická a hostitelská variabilita viru, která je základem pro vypracování spolehlivých diagnostických metod. Porovnání nově získaných izolátů RaMV s typovým evropským a kalifornským kmenem viru prokázalo, že v Evropě se vyskytují izoláty výrazně odlišné sérologicky i okruhem hostitelských rostlin. Byla tak vyvrácena existující hypotéza o sérologické uniformitě evropských izolátů viru.

• Špak, J., Kubelková, D.: Serological variability among European isolates of radish mosaic virus. - Plant Pathol. 49, 295-301 (2000).

5.20. Fosfoprotein asociovaný s mikrodoménami obohacenými o glykosfingolipidy (PAG), nový obecně exprimovaný transmembranový adaptorový protein, se váže na protein tyrozin kinázu Csk a účastní se regulace aktivace T buněk

Spuštění imunitní odpovědi je založeno na rozeznávání cizorodých látek (antigenů) pomocí několika druhů tzv. imunoreceptorů na povrchu různých typů leukocytů (bílých krvinek, t.j. buněk tvořících imunitní systém). Po navázání antigenů na imunoreceptory se spouští složitá kaskáda signalizačních dějů, která vyvolá patřičnou funkční odezvu - podle okolností např. dělení a diferenciaci příslušných bílých krvinek, nebo naopak jejich útlum či dokonce úmrtí, produkci protilátek nebo regulačních proteinů zvaných cytokiny. Ukazuje se, že úvodní fáze imunoreceptorové signalizace jsou závislé na organizovaných shlucích několika povrchových a signalizačních molekul nazývaných "signalizační mikrodomény" nebo také "GEMs" (glycosphingolipid-enriched microdomains). Zásadně důležitými složkami těchto útvarů jsou enzymy proteinkinasy skupiny Src, které celou signalizační dráhu vlastně zahajují. Aktivita těchto klíčových enzymů je tlumena jiným podobným enzymem, kinasou Csk. V této práci se nám podařilo ve spolupráci se skupinou dr. Schravena (Univ. Heidelberg) vyklonovat gen kódující nový membránový protein přítomný také v signalizačních mikrodoménách. Tento protein nazvaný PAG (phosphoprotein associated with GEMs) vytváří komplex s kinasou Csk, přivádí ji takto do blízkosti kinas skupiny Src a tím vlastně reguluje regulační enzym Csk. Naše experimenty ukazují, že bezprostředně po zahájení imunoreceptorové signalizace se komplex PAG-Csk rozpadá, což umožní aktivaci příslušných Src-kinas. Zdá se, že správná funkce systému PAG-Csk-Src kinasy je velmi důležitá pro regulaci buněčného dělení a správné nastavení citlivosti imunitní odpovědi. Poruchy interakcí mezi PAG a Csk by se mohly podílet na vzniku některých nádorových a autoimunitních onemocnění.

• T.Brdička, D.Pavlištová, A.Leo, E.Bruyns, V.Kořínek, P.Angelisová, J.Scherer, A.Shevchenko, A.Shevchenko, I.Hilgert, J.Černý, K.Drbal, Y.Kuramitsu, B.Kornacker, V.Hořejší, B.Schraven: J.Exp.Med. 191: 1591-1604, 2000.

5.21. Klonování a charakterizace str operonu a exprese elongačního faktoru Tu z Bacillus stearothermophilus

Prostředí, ve kterém bakterie přirozeně žijí, se neustále mění. Optimální podmínky pro růst se střídají se stresovými situacemi, mezi něž patří např. hladovění. Bakterie jsou na tyto změny velmi dobře adaptovány, za optimálních podmínek rostou a množí se velmi rychle a naopak, za stresových situací se růst i množení zpomalují. Podobné souvislosti, i když třeba v ještě složitější formě, platí samozřejmě i pro všechny vyšší organismy. Náplní naší práce je objasňování mechanismů, uplatňujících se při regulaci těchto dějů.
Bakteriální růst je přímo propojen se schopností buněk budovat nové bílkoviny, tj. s proteosyntézou. Té přísluší hlavní role v obecném metabolismu buňky a při jejím růstu. Organely, na kterých proteosyntéza probíhá jsou ribosomy a jim sekundují další nezbytné složky - bílkovinné faktory nazvané iniciační, elongační a terminační. Změna v růstové rychlosti znamená, že se také rychlost proteosyntézy musí změnit. Musí se tedy změnit i počet ribosomů a molekul faktorů. Regulace syntézy všech těchto složek (je jich více než 100) a zajištění jejich proporcionální produkce a přítomnosti v buňce je neobyčejně komplexní proces.

V naší práci se nám podařilo určit strukturu dvou základních bakteriálních elongačních faktorů EF-Tu a EF-G u Gram-positivní, středně termofilní bakterie Bacillus stearothermophilus a odhalit molekulární mechanismy, jakými je řízena produkce těchto faktorů z jejich genů. Ukázalo se, že je zde použita nová, dosud nepopsaná strategie regulace exprese těchto genů jejíž platnost jsme ověřili i u Gram-positivní bakterie Bacillus subtilis a která bude možná platit i pro další Gram-positivní organismy. Objasňování těchto mechanismů je důležité pro poznání fysiologie bakteriální buňky, ale může přispět i k porozumění mnohotvárným způsobům regulace genové exprese u všech organismů. Praktický příspěvek těchto studií lze očekávat v oblasti vývoje účinných bakteriostatik.

• Krásný, L., Vacík, T., Fučík, V., Jonák, J. J. Bacteriol. 182 (2000), 6114-6122.

  Využití monoklonálních protilátek proti proteinům lidských spermií k diagnostice patologie spermií a výběru vhodné metody fertilizace v asistované reprodukci

Za významný výsledek v této oblasti považujeme přípravu monoklonálních protilátek proti proteinům lidských spermií, které jsou využívany v praxi při asistované reprodukci v IVF laboratoři ISCARE a.s.

Tyto protilátky lze aplikovat v diferenciální diagnostice patologických spermií (kvantifikace proteinů) a k hodnocení fysiologického stavu buněk (stádium před a po akrosomální reakci). Protilátky mohou být také užity pro výběr vhodné metody asistované reprodukce (intrauterinní inseminace, standardní in vitro fertilizace, introcytoplasmatický přenos jádra) v prvním cyklu asistované reprodukce. S výhodou jsou protilátky využívány pro hodnocení ejakulovaných spermií i spermií získaných aspirací z epididymis nebo extrakcí z testes.

Chládek D., Pěknicová J., Čapková J., Geussová G., Teplá O., Madar J.: Česká Gynekologie: 65 No 1: 28-32, 2000

Teplá O., Pěknicová J.: Slov. Gynek. Porod. 6:14-17, 1999

5.23. Devitalizační technika jako nový postup při léčbě zhoubných nádorů

Devitalizační technika je chirurgický postup, který vyvinul MUDr. Karel Fortýn, CSc. pro léčbu maligních nádorů. Její princip spočívá v izolaci nádoru od cévního zásobení, kterého je dosaženo podvázáním příslušných arteriálních a venózních cév. Takto ošetřený nádor je pak ponechán v organizmu. Postupně dochází k zániku všech nádorových buněk, a to v primárních nádorech i v metastázách. Zatím získané nepřímé důkazy naznačují, že nádorové buňky rozpadající se v devitalizované tkáni aktivují imunitní systém, který cestou buněčných imunitních mechanizmů způsobí zánik nádorových buněk v celém organizmu.

Pro experimentální účely byla v ÚŽFG v Liběchově vyšlechtěna speciální linie miniprasat MeLiM (Melanoma-bearing Libechov Minipigs) s dědičně založenými zhoubnými kožními nádory - melanomy. Ty jsou obvykle mnohočetné a vykazují mnoho histopatologických podobností s lidským melanomem včetně výrazných metastáz ve vnitřních orgánech a vysoké mortality. Do současné doby bylo devitalizační technikou úspěšně vyléčeno kolem sta miniprasat s melanomy. Výsledky s devitalizační léčbou karcinomu mléčné žlázy u psů (zatím ošetřeno 27 fen) ukazují pozitivní účinek tohoto zákroku u dalšího typu nádoru u jiného živočišného druhu.

Po medializaci dosažených výsledků byl navázán kontakt s několika klinickými pracovišti (včetně Masarykova onkologického ústavu v Brně), která o devitalizační techniku projevila zájem a byl probuzen rovněž zájem Ministerstva zdravotnictví, jehož souhlas je nezbytný pro klinické zkoušky. I kdyby devitalizační technika byla účinná jen u některých typů nádorů, představovala by, kromě výrazné úspory finančních prostředků vynakládaných na chemoterapeutickou léčbu, především záchranu stovek lidských životů.

• Horák, V., Fortýn, K., Hruban, V., Klaudy, J.: Hereditary melanoblastoma in miniature pigs and its successful therapy by devitalization technique. - Cell. Mol. Biol. 45: 1119-1129 (1999).

5.24. Zkrácené analogy lidského inzulínu

Krácení karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského inzulínu má ve vztahu k biologickému účinku své limity. Minimální délka B-řetězce inzulínu je 25 aminokyselin, a to ještě za předpokladu, že koncový karboxyl fenylalaninu je amidován. Náš postup krácení řetězce zachovává sekvence B²²- B²⁶ a modifikuje peptidovou vazbu mezi fenylalaniny substitucí vodíku v NH skupině metylovu skupinou. Výsledný analog má vyšší metabolickou stabilitu proti peptidovému štěpení než přirozená forma lidského inzulínu. V molekule lidského inzulínu je sekvence B²⁵- B²⁶ tvořena fenylalaninem a tyrosinem. O zkráceném derivátu inzulínu se sekvencí B²³-B²⁶ Gly-Phe-Phe-TyrNH2 je známo, že má zachovanou biologickou aktivitu, ale peptidové (amidové) vazby B²⁴-B²⁶ jsou enzymově snadno degradovatelné. Byly proto připraveny dva tetrapeptidy - analogy B²³-B²⁶, které byly enzymově katalyzovanou semisyntézou připojeny na karboxyl argininu B²². Oba analogy si plně zachovaly biologický účinek v explantátech mléčné žlázy, kde svým působením na receptor IGF-I stimulovaly syntézu DNA a v explantátech tukové tkáně, kde svým působením na receptor inzulínu stimulovaly syntézu lipidů.

Klasová L., Ježek J., Barthová J., Velek J., Velková V., Kašička V., Ubik K., Škarda J., Wollmer A., Brandenburg D., Zorád Š., Huml K., Barth T.: Zkrácené deriváty lidského inzulínu. Osvědčení o zápisu užitného vzoru, Úřad průmyslového vlastnictví ČR, č. přihlášky 2000-10361.

Klasová L., Barthová J., Škarda J., Zorád Š., Velek J., Ježek J., Farkašová J., Velková V., Ubik K., Kašička V., Barth T.: Zkrácené deriváty lidského inzulínu s modifikovaným tyrosinem v poloze B²⁶. Osvědčení o zápisu užitného vzoru, Úřad průmyslového vlastnictví ČR, č. přihlášky 2000-11376.