5. Sekce biologických a lékařských věd
Seznam anotací:
- Strukturní invariance guaninových bloků v různých uspořádáních DNA (BFÚ)
- Oprava DNA po působení kadmia je doprovázena zvýšenou aktivitou telomerázy v rostlinných buňkách (BFÚ)
- Strukturální podstata hedvábného vlákna (ENTÚ)
- Dlouhodobé časové a prostorové změny biodiverzity (ENTÚ)
- Modelování rozložení druhů v prostředí (ENTÚ)
- Nové typy mitochondriálních chorob (FGÚ)
- Molekulový mechanismus savčích biologických hodin v průběhu roku (FGÚ)
- Farmakogenetický důkaz pro rozhodující úlohu Cd36 při antidiabetických účincích glitazonů (FGÚ)
- Detekce Bartonella henselae in situ (MBÚ)
- Molekulární taxonomie námele (MBÚ)
- Biofyzika růstu pylové láčky (ÚEB)
- Regulace buněčného dělení auxiny (ÚEB)
- Úloha polyaminů v růstu a vývoji rostlin (ÚEB)
- Organizace aktivních ribozomálních genů v jadérku (ÚEM)
- Zpětnovazební mechanismy ve sluchovém systému a jejich plasticita (ÚEM)
- Molekulární mechanismy regulující proliferaci a diferenciaci kmenových a nádorových buněk (ÚEM)
- Interakce v reakčních centrech fotosystému II (ÚMBR)
- Nový membránový protein bílých krvinek (NTAL) uplatňující se v přenosu signálu do nitra buňky (ÚMG)
- Aktivace genu twist se podílí na vzniku nádorů ledvin - nefroblastomů (ÚMG)
- Využití genomiky pro studium endogenních i infekčních retrovirů (ÚMG)
- Bakterie produkující butyrát v trávicím traktu přežvýkavců - pomocníci produkující antikancerogenní látky (ÚŽFG)
- Biodiverzita středoevropských ryb je větší než se předpokládalo - molekulární biologie jako účinný nástroj ochrany biologické rozmanitosti (ÚŽFG)
- Nové poznatky o mechanismu zrání savčích oocytů a možnosti jeho ovlivnění (ÚŽFG)
5.1. Strukturní invariance guaninových bloků v různých uspořádáních DNA
Michaela Vorlíčková
Ukázali jsme, že shluky guaninových nukleotidů nabývají stejného uspořádání v klasické dvoušroubovici DNA, v dvoušroubovici, které nabývá RNA, v tetraplexu DNA i v uspořádaném jednořetězci DNA. Tato strukturní invariance vyplývá ze silných interakcí mezi guaniny. Schopnost guaninů být klíčovou součástí jedno-, dvou- i čtyřřetězcových uspořádání nukleových kyselin může být relevantní ke vzniku prvních replikátorů na Zemi.
Výsledky jsou shrnuty v následujících publikacích:
Kypr, J., Vorlíčková, M.: Circular dichroism spectroscopy reveals invariant conformation of guanine runs in DNA. - Biopolymers (Biospectroscopy) 67: 275-277 (2002)
Štefl, R., Trantírek, L.,Vorlíčková, M., Koča, J., Sklenář, V., Kypr, J.: A-like guanine-guanine stacking in the aqueous DNA duplex of d(GGGGCCCC). - J. Mol. Biol. 307: 513-524 (2001)
Kypr, J., Fialová, M., Chládková, J., Tůmová, M., Vorlíčková, M.: Conserved guanine-guanine stacking in tetraplex and duplex DNA. - Eur. Biophys. J. 30: 555-558 (2001)
5.2. Oprava DNA po působení kadmia je doprovázena zvýšenou aktivitou telomerázy v rostlinných buňkách
Aleš Kovařík
Během fragmentace genomu tabákových buněk BY-2 vyvolané kademnatými ionty a během následné opravné fáze byla zjištěna zvýšená aktivita telomerázy. Studie ukázaly, že integrita genomu může být plně obnovena i po jeho kompletní fragmentaci na 50 - 200 kb úseky a telomeráza se účastní tohoto vysoce účinného opravného procesu.
Výsledky jsou shrnuty v následující publikaci:
Fojtová, M., Fulnečková, J., Fajkus, J., Kovařík, A.: Recovery of tobacco cells from cadmium stress is accompanied by DNA repair and increased telomerase activity. - J. Exp. Bot. 53:
5.3. Strukturální podstata hedvábného vlákna
Hedvábí známé jako textilie se vyrábí z vláken, které předou některé druhy housenek. Vlákna vznikají řízenou polymerizací bílkovin vylučovaných v přeměněných slinných žlázách. Při polymerizaci se molekuly bílkovin, dosud neuspořádané v hustém roztoku uvnitř žláz, paralelně propojují pomocí slabých interakcí, jejichž charakter určuje vlastnosti vlákna. Na typ interakcí můžeme usuzovat ze složení bílkovin hedvábí a na základě těchto a dalších podkladů případně navrhnout strukturu bílkovin pro tvorbu hedvábného vlákna průmyslovým způsobem. Komerčně dostupné typy přírodního hedvábí nejsou ty nejlepší, které příroda nabízí. Např. komerčně nedostupné (protože zámotky nelze spřádat ve vlákno) hedvábí produkované housenkami zavíječe voskového se vyznačuje neobvyklou kombinací pevnosti a pružnosti. Analýza genu těžkého řetězce fibroinu, který je pro tvorbu vlákna klíčový, odhalila že u tohoto druhu je složení fibroinu vysoce specifické. Více než 95% bílkoviny sestává z dvanácti bloků o složení AB1AB1AB1AB2AB2(AB2), kde každé A je úsek 63 aminokyselin, B1 43 aminokyselin a B2 19 aminokyselin. Uvnitř každého úseku jsou skupiny aminokyselin, které umožňují mezimolekulární interakce a polymerizaci vlákna. Homogenita opakovaných úseků A, B1a B2 je mimořádná co do délky i složení a tato pravidelnost je vedle zastoupení různých aminokyselin zřejmě určující pro vynikající vlastnosti hedvábí. U příbuzných druhů byly nalezeny jiné skupiny a jiná délka opakovaných úseků. Výsledky prokázaly, že gen těžkého fibroinu se v evoluci rychle mění v souvislosti s nároky, které způsob života daného druhu klade na vlastnosti hedvábného vlákna.
Fedič R., Žurovec M., Sehnal F. (2002): The silk of Lepidoptera. J. Ins. Biotechnol. Sericol. 71: 1-15.
Žurovec M. a Sehnal F. (2002) Unique molecular architecture of silk fibroin in the waxmoth, Galleria mellonella. J. Biol. Chem. 277: 22639-22647.
5.4. Dlouhodobé časové a prostorové změny biodiverzity
Většina údajů o biodiverzitě je založena na jednorázovém a nebo jen několikrát nepravidelně opakovaném mapování výskytu určité skupiny organismů na malých územích. Proto má nadnárodní význam jednadvacetiletá studie výskytu motýlů na mokřadní olšině Černiš u Českých Budějovic. Jedná se o ojedinělý biotop, kde je na jednom km2 více než 920 druhů, tj. téměř 30 % všech motýlů známých z České republiky. Některé ohrožené druhy se v Čechách pouze vyskytují zde. Výsledky výzkumu za léta 1981-2001 byly shrnuty v monografii, ve které je pro každý druh uveden okruh živných rostlin a kolísání velikosti populací imág za sledované období. Z prostorového aspektu byla zkoumána biodiverzita pavouků na území celé ČR, která má z biogeografického hlediska mimořádné postavení. Má pestrou geologickou stavbu, poměrně členitý reliéf a v posledním ledovém období tudy koridor spojující nezaledněné oblasti na východě a v západní Evropě. Díky poloze v samém centru střední Evropy se zde vždy prolínaly vlivy nejen chladného severu a teplého jihu, ale i oceánského západu a kontinentálního východu. Tyto vlivy se promítají i do biodiverzity pavouků. Do konce roku 2000 se u nás našlo 830 druhů pavouků, náležejících do 37 čeledí. Byly shrnuty údaje o jejich geografickém rozšíření, charakteru stanovišť a stupni ohrožení. Vytvořená databáze umožňuje připojení ke světové informační soustavě o biodiverzitě (GBIF).
Buchar J. a Růžička V. (2002) Catalogue of Spiders of the Czech Republic. Peres Co. Publishers and Booksellers, Praha, Czech Republic, pp. 349.
Jaroš J. a Spitzer K. (2002): Food plants of Lepidoptera associated with an alter carr forest in South Bohemia (Central Europe). Sborník Jihočes. Mus. v Čes. Budějovicích 42 (Suppl.), 5-60.
5.5. Modelování rozložení druhů v prostředí
Pro pochopení funkce ekologických systémů je důležitá znalost mechanismů ovlivňujících prostorové rozmístění jednotlivých druhů a populací v přírodě. Jedním z těchto mechanismů je vnitro a mezidruhová kompetice o potravní zdroje, prostor, partnery a pod. Předpokládá se, že při zvyšujícím se počtu jedinců dochází ke snížení zdatnosti (fitnes) průměrného jedince což vede ke snižování reprodukčních schopností a délky přežívání. Ve snaze eliminovat tyto nepříznivé tendence jedinci vyhledávají nová stanoviště, která jim zabezpečí vyšší průměrnou zdatnost. Tyto představy vedly k teorii tzv. ideálního volného rozložení populace, která je pro jedinou populaci považována za základní model jejího prostorového rozložení. Rozšířením této teorie na více populací se zabývala řada prací, které však zkoumaly obvykle pouze speciální, poměrně jednoduché případy. V případě dvou nebo více kompetujících si populací se jejich prostorové rozložení vzájemně ovlivňuje. Vzniká tak otázka, zda-li je vůbec možné a priori predikovat rozložení pro dvě a více populací. Řešení uvedeného problému vyžaduje využití teorie her rozpracovaném J. Maynard Smithem pod názvem evolučně stabilní strategie. S využitím tohoto přístupu jsme teoreticky popsali rozložení dvou kompetujících si druhů v prostorově nehomogenním prostředí skládajícím se ze dvou nik. Pro daný model jsme stanovili podmínky, za kterých dochází k prostorové segregaci jednotlivých populací a podmínky, které vedou ke společné koexistenci obou druhů v jednotlivých nikách. Ukázali jsme, že vysoká relativní míra mezidruhové kompetice vůči kompetici vnitrodruhové vede k tomu, že výsledné prostorové rozložení může záviset na časovém průběhu kolonizace a nemusí být jednoznačně určeno. Prostorového rozložení dvou populací lze tedy předpovědět pokud je vnitrodruhová kompetice silná ve srovnání s mezidruhovou kompeticí. Výsledky mají význam pro pochopení vlivu kompetice na prostorového rozložení druhů a vytváří řadu testovatelných hypotéz pro další experimentální studie.
Krivan, V., Sirot, E.: Habitat selection by two competing species in a two patch environment. American Naturalist, 160, 214-234, 2002.
Krivan, V. Ideal Free Ditribution when Resources undergo population dynamics. Theoretical Population Biology, In review.
5.6. Nové typy mitochondriálních chorob.
MUDr. J. Houštěk, DrSc.
Nedostatečný přísun energie pro vitální funkce organismu způsobený poruchami mitochondrálních enzymů oxidační forsforylace je příčinou velké skupiny závažných metabolických chorob, které vedou k progredujícímu postižení nervosvalového aparátu a dalších orgánů s vysokými energetickými nároky. Obzvláště těžký, často fatální průběh mají mitochondrální choroby novorozenců a dětí vyvolané defekty dvou enzymů respiračního řetězce - cytochrom c oxidázy a mitochondriální ATPázy. Ve spolupráci s Klinikou dětí a dorostu a Ústavem dědičných metabolických poruch 1. Lékařské fakulty UK v Praze se podařilo diagnostikovat a detailně charakterizovat několik nových typů mitochondriálních chorob způsobených poruchami biosyntézy a funkce katalitycké nebo membránové části ATPázy a poruchami sestavování multipodjednotkového komplexu cytochrom c oxidázy, jehož příčinou je chybění specifického asemblačního proteinu Surf1. Významným výsledkem pro objasňování molekulárních mechanismů vzniku mitochondriálních chorob je i nález nového místa tvorby reaktivních kyslíkových radikálů v respiračním řetězci, které představuje mitochondriální glycerofosfát dehydrogenáza. Komplexní studium mitochondriálních poruch od klinických projevů až po vyvolávající mutace v jaderných a mitochondriálních genech bylo umožněno aplikací nových biofyzikálních a molekulárně genetických metod, které jsou cíleně rozvíjeny v rámci Centra pro funkční genomiku AV ČR. Získané poznatky jsou přímo využitelné v diagnostice a genetickém poradenství dědičných mitochondriálních chorob, pro které v současnosti neexistuje žádná účinná terapie.
Antonická H., Floryk D., Stratilová L., Klement P., Heřmanská J., Houšťková H., Zeman J. and Houštěk J.: Defective kinetics of cytochrome c oxidase and alteration of mitochondrial membrane potential in fibroblasts and cybrids with MERRF mutation at position 8344 nt. Biochem. J. 342:537-544, 1999
Houštěk J., P. Klement, J. Heřmanská, H. Antonická, H. Houšťková, L.Stratilová, R. Wanders and J. Zeman. Complex Approach to Prenatal Diagnostics of Cytochrome c Oxidase Deficiencies. Prenatal Diagnosis. 19:552-558, 1999.
Houštěk J, Klement P, Floryk D, Antonická H, Heřmanská J, M. K, Hansíkova H, Houštková H, Chowdhury SKR, Rosipal S, Kmoch S, Stratilová L, Zeman J.: A novel deficiency of mitochondrial ATPase of nuclear origin. Hum.Mol.Genetics 8:1967-1974, 1999.
Chowdhury S. K. R., Drahota Z., Floryk D., Calda P., Houštěk J.: Activities of mitochondrial oxidative phosphorylation enzymes in cultured amniocytes. Clinica Chimica Acta 298:157-173, 2000.
Houštěk J. - Genetic Aspects of Mitochondrial Encephalomyopathies. Biologia 55:209-221, 2000.
Siôn L. Williams, Jan-Willem Taanman, Hana Hansíková, Hana Houšťková, Subir Chowdhury, Jiří Zeman and Josef Houštěk: A novel mutation in SURF1 causes skipping of exon 8 in a patient with cytochrome c oxidase deficient Leigh syndrome and hypertrichosis. Molecular Genetics and Metabolism 73:340-343, 2001.
Čapková M., Hansíková H., Godinot C., Houšťková H., Houštěk J., Zeman J.: A novel missence mutation C574T in SURF1 gene - biochemical and molecular studies in seven children with Leigh syndrome. Čas Lék Česk 141: 636-641, 2002.
Tesařová M., Hansíková H., Hlavatá A., Klement P., Houšťková H., Houštěk J., Zeman J.: Variation in manifestations of heteroplasmic mtDNA mutation 8993 T>G in two families. Čas Lék Česk. 141:551-554, 2002.
Drahota Z, Chowdhury SK, Floryk D, Mracek T, Wilhelm J, Rauchova H, Lenaz G, Houstek J. Glycerophosphate-dependent hydrogen peroxide production by brown adipose tissue mitochondria and its activation by ferricyanide. J Bioenerg Biomembr. 34:105-13, 2002.
5.7. Molekulový mechanismus savčích biologických hodin v průběhu roku
PharmDr. Alena Sumová, CSc.
Denní časový řád savců je řízen biologickými hodinami, které se nacházejí v části mozku zvané suprachiasmatická jádra. Pomocí různých ukazatelů neuronální aktivity bylo dříve prokázáno, že biologické hodiny reagují na délku světlé části dne. Podstatou denních oscilací vznikajících v biologických hodinách jsou vzájemně propojené pozitivní a negativní zpětnovazebné smyčky mezi zapínáním a vypínáním "hodinových genů" a působením jim odpovídajících proteinů. Nejdůležitější z těchto genů jsou Per1,2, Cry1,2, Bmal1, Clock a kasein kinaza 1e. Pracovníci Fyziologického ústavu stanovili, jak délka světlé části dne ovlivňuje denní zapínání a vypínání čtyř reprezentantů hodinových genů, jmenovitě Per1, Cry1, Bmal1 a Clock a tvorbu proteinu PER1 v biologických hodinách potkana. Délka dne modulovala dobu, po kterou byly zapnuty či vypnuty geny Per1 a Bmal1 a tvořil se protein PER1 a ovlivňovala čas zapnutí genu Cry1. Zapínání genu Clock vykazovalo denní rytmus pouze tehdy, byli-li potkani chováni na krátkých zimních, ale ne na dlouhých letních dnech. Na krátkých zimních dnech byla také amplituda denních rytmů v zapínání a vypínání sledovaných genů a tudíž v přepisu jejich informace významně vyšší než na dlouhých letních dnech. Výsledky ukazují, že molekulový mechanismus podmiňující chod biologických hodin savců je ovlivněn délkou vnějšího denního světla. Tyto změny pak mohou být podkladem ročních změn ve fyziologii a chování savců.Sumová A., Sládek M., Jáč M., Illnerová H.: The circadian rhythm of Per1 gene product in the rat suprachiasmatic nucleus and its modulation by seasonal changes in daylength. Brain Research 947: 260-270 (2002).
Sumová A., Jáč M., Sládek M., Šauman I., Illnerová H.: Clock gene daily profiles anf their phase-relationship in the rat suprachiasmatic nucleus are affected by photoperiod. J Biol. Rhythms, accepted in press in 12/02.
5.8. Farmakogenetický důkaz pro rozhodující úlohu Cd36 při antidiabetických účincích glitazonů
Ing. Michal Pravenec, DrSc.
Diabetes 2. typu patří mezi hlavní příčiny morbidity a mortality v moderních civilizacích. Mezi hlavní fyziologické abnormality asociované s diabetem 2. typu patří snížená citlivost tkání k účinkům inzulinu (inzulinová rezistence), která podmiňuje poruchy metabolizmu glukózy a tuků a tím nakonec způsobuje závažná onemocnění srdce a cév. Pioglitazone (Actos) patří mezi novou skupinu antidiabetických léků, tzv. glitazonů, které zvyšují citlivost tkání k účinkům inzulinu. Glitazony aktivují řadu genů ovlivňujících metabolizmus tuků a uhlovodíků, ale není známo, které z těchto mnoha genů jsou nezbytné pro antidiabetické účinky glitazonů. Pomocí analýzy specifických transgenních linií spontánně hypertenzních potkanů kmene SHR byl získán přímý farmakogenetický důkaz pro důležitou úlohu genu Cd36 (kódujícího transportér mastných kyselin) při antidiabetických účincích pioglitazonu. Naše výsledky přispěly k pochopení mechanizmu účinků glitazonů a mohly by tak být důležité pro racionální využití těchto látek při terapii a pro vývoj nových glitazonových preparátů.
N. Qi, L. Kazdová, V. Zídek, V. Landa, V. Křen, H. A. Pershadsingh, E. St. Lezin, M. Pravenec, T. W. Kurtz: Pharmacogenetic evidence that Cd36 is a key target gene mediating the metabolic effects of pioglitazone, J. Biol. Chem. 277:48501-48507, 2002
5.9. Detekce Bartonella henselae in situ
Rod Bartonella byl poprvé ustaven v roce 1915 objevením bakterie Bartonella bacilliformis, vyvolavatele smrtelné horečky Oroya a benigního onemocnění veruga peruana. Skutečnost, že jedna bakterie vyvolává dvě tak zásadně odlišné choroby prokázal tragický experiment peruánského studenta medicíny Daniela Carriona, který se v badatelském zápalu záměrně infikoval krví pacienta s benigní veruga peruana, ale za nějakou dobu zemřel na horečku Oroya. V současné době je známo asi 16 druhů bartonel, z nichž 6 je schopných vyvolat onemocnění u člověka. Výskyt B. quintana, která během obou světových válek decimovala na všech frontách vojáky jako původce obávané zákopové horečky, je dnes pouze sporadický, především u alkoholiků, bezdomovců a pacientů s HIV. B. heselae byla identifikována v roce 1993 jako více než 100 let hledaný původce "nemoci z kočičího škrábnutí", postihující lymfatický systém. Dále se může manifestovat jako prudký zánět spojivek, mozkových blan nebo srdečního svalu. U HIV pozitivních pacientů vyvolává život ohrožující onemocnění - bacilární angiomatosu, která bývá zaměňována za Kaposiho sarkom. Z tohoto důvodu je správná diagnostika bartonelových onemocnění naprosto nezbytná.
Diagnostika onemocnění způsobených B. henselae je nesmírně obtížná. Kultivace je velmi náročná a zpravidla neúspěšná. V současnosti jsou suverénně nejpoužívanější imunologické metody, které ovšem mohou reagovat nespecificky a navíc protilátky proti B. henselae zkříženě reagují s B. quintana, chlamydiemi nebo Coxiella burnetii. Nejspolehlivější a nej-specifičtější jsou metody založené na detekci DNA B. henselae. Do této kategorie patří i detekce hybridizací in situ.
Hybridizace in situ je technika umožňující detekovat hledanou sekvenci nukleových kyselin v celých buňkách i tkáňových řezech pomocí krátkých specifických úseků DNA nebo RNA (tzv. sond), na které jsou chemicky přivěšeny molekuly, které je možno přímo, či nepřímo detekovat a vizualizovat tak hledaný objekt.
Jako sonda byla pro hybridizaci použita krátká DNA, která odpovídá části chromozomální DNA B. henselae a nachází se pouze v genomu této bakterie. Po vlastní hybridizační reakci a odmytí nenavázané sondy je možné bakterie, k jejichž DNA se sonda navázala, vizualizovat ve fluorescenčním mikroskopu, nebo pomocí barevné chemické reakce. Bakterie se tak v mikroskopu jeví jako barevné, nebo svítící buňky na neobarveném, nebo temném pozadí. Jelikož během hybridizační procedury nedochází k poškozování preparátu, je možné zároveň sledovat i patologické změny v příslušné tkáni. Kontrolní reakce s ostatními bartonelami a dalšími bakteriemi, které se běžně vyskytují v infekčním materiálu potvrdily, že sonda reaguje specificky pouze s buňkami B. henselae a je tak schopna odlišit infekci B. henselae od B. quintana, což běžné imunologické metody nedokáží. Nespornou výhodou je i relativní jednoduchost a finanční nenáročnost vyvinuté metody. V současné době ověřujeme hypotézu, podle které by bartonely mohly být šířené klíšťaty. Klíšťata by tak vedle lymské boreliozy a encefalitidy byly rezervoárem dalších onemocnění.
Hercík, K., Melter, O., Janeček, J., and Branny, P. (2002) In situ detection of Bartonella henselae cells. Molecular and Cellular Probes 16: 49-56
5.10. Molekulární taxonomie námele
Rod Claviceps zahrnuje cca 50 druhů, parazitujících na květech trav. Nejznámější z nich je Claviceps purpurea (paličkovice nachová), známá jako námel na travách a obilninách mírného pásma. Většina ostatních druhů se však vyskytuje v tropických a subtropických oblastech. Dormantní stadium námele, sklerocium, může obsahovat jedovaté alkaloidy (toxikózy při požití chleba z kontaminované mouky u lidí, při spasení trávy se sklerociemi u dobytka, nebo při požití krmných směsí z kontaminovaných obilnin). Proto studujeme výskyt hostitelské popř. místní specificity, výskyt, populační strukturu a způsob šíření různých druhů Claviceps a jejich potenciál pro tvorbu toxinů.
Tvorba alkaloidů byla dokumentována pro C. purpurea, z tropických druhů pak u C. fusiformis, C. africana a C. paspali. V naší laboratoři jsme v současné době prokázali tvorbu alkaloidů také v kulturách C. zizaniae.
U C. purpurea byla předpokládána existence ras kolonizujících určité skupiny trav, ale různí autoři se ve svých definicích ras rozcházeli. Teprve použitím molekulárně genetických metod se nám podařilo prokázat, že populace (rasy) C. purpurea jsou specifické ne pro hostitele, ale pro určitý biotop. Dosud jsme nalezli tři rasy, které se liší jak v molekulárně-taxonomických znacích, tak i výskytu, vzhledu spór a v neposlední řadě také typem produkovaných alkaloidů: G1 (pole, louky, podél cest), G2 (podél vodních ploch, na okraji lesů, v horách) a G3 (přímořská slaniska Atlantiku). Rasy mají jisté hostitelské preference pro travní druhy, které jsou pro daný biotop typické (např. bezkolenec a rákos pro G2, pýr a jílek pro G1), zatímco trávy s nespecifickým výskytem (srha) jsou hostitelé univerzální pro všechny tři rasy. Tato skutečnost by měla nalézt uplatnění při testování námelové rezistence u novošlechtění trav v závislosti pro oblast jejich určení.
Získali jsme sekvence rDNA z celkem 23 druhů Claviceps a jejich analýzou vznikl vývojový strom parazita, který však zcela nesleduje vývojový strom hostitelů (trav). Studium fylogeneze Claviceps a populační struktury některých druhů Claviceps (C. purpurea, C. africana), ukázalo, že tito parazité se šíří zároveň se svými hostiteli na větší vzdálenosti, avšak v nově obsazené oblasti mohou vznikat populace, kolonizující jiné hostitelské trávy bez ohledu na jejich příbuznost s hostitelem původním. Tyto populace se postupně specializují za vzniku sesterských druhů. Tato strategie se může uplatnit i při zavlečení některého druhu Claviceps do jiné oblasti (v současnosti C. africana, parazit čiroku) působením člověka (globální obchod osivy a zrním).
Studium různých druhů Claviceps je důležité také z hlediska produkce extracelulárních polysacharidů, beta-1-3-glukanů. Hlavním účinkem těchto látek je stimulace imunitního systému člověka, především aktivace makrofágů, která je následně provázena aktivací i ostatních částí imunitního systému tj, T a B buněk. Tohoto účinku je využíváno především v podpůrné léčbě některých nádorových onemocnění. V současné době byla vypracována technologie jejich fermentační přípravy, vyhledáni vhodní producenti a patentována zcela originální metoda jejich izolace z fermentačních medií (PV). Testování imunomodulačních vlastností takto připravených nanočástic je předmětem dalšího studia.
Pažoutová S., Johnson N., Kolařík M., and Rajasab AH (2002) Heteropogon triticeus - a new host for Claviceps sorghi in India. J. Phytopathol. 150: 1-4.
Pažoutová S., Raybould A.F., Honzátko A., Kolínská R. (2002) Genotypic and phenotypic variation in Claviceps purpurea from Spartina species and the origin of the ergot infection on S. anglica in the British Isles. Mycol. Res. 106 (2): 210-214
5.11. Biofyzika růstu pylové láčky
Laura Zonia
Samčí pohlavní buňky vyšších rostlin nejsou pohyblivé, a tak musí být dopraveny k vajíčku, aby mohlo dojít k oplodnění. Pylové zrno dopadne na bliznu květu a vyklíčí. Nejprve se na buňce vytvoří malý výstupek a z něj vznikající pylová láčka prorůstá čnělkou směrem k semeníku s vajíčky. Když pylová láčka doroste až k vajíčku, vytvoří zduřeninu, jejíž tlak způsobí, že se buňka v blízkosti špičky láčky náhle roztrhne. Tato exploze nastřelí samčí pohlavní buňky do vajíčka a dojde k oplodnění. Znalost toho, jak pylová láčka roste, lze využít v technikách vedoucích ke zvýšení zemědělského výnosu.
Pylová láčka roste buď rovnoměrnou rychlostí nebo rychlost růstu pravidelně kolísá. Dosud nebyla známa příčina tohoto kolísání. Prokázali jsme, že hlavním regulátorem kolísání růstové rychlosti je výtok chloridových iontů na špičce pylové láčky (Zonia et al. 2001, 2002). Výtok chloridových iontů je řízen nelineárním harmonickým oscilátorem. Podstatné je, že oscilátor chloridových iontů je zapnutý dříve než dojde k oscilacím v růstu (Zonia and Feijo 2003). Chloridový oscilátor je úzce spřažený se změnami hydrostatického tlaku buňky a dostává povely z důležité signální kaskády řídící výstupní frekvence oscilátoru (Zonia et al. 2002, Zonia and Feijo 2003). Zdá se, že tento oscilátor je schopen přeměnit pylovou láčku na jakési "pneumatické kladivo", které umožňuje buňkám pronikat tkání rostliny.
Klíčící pylové láčky tabáku (Nicotiana tabacum L.) ve fluorescenčním mikroskopu. Tubulin (jeden typ vláken cytoskeletu) je značen zeleně, jádro pylové láčky modře. Světle modré zbarvení špičky ("hlavičky") pylové láčky je dáno autofluorescencí.
Gibbon, B.C., Zonia, L.E., Kovar, D.R., Hussey, P.J., Staiger, C.J.: Pollen profilin function depends on interaction with proline-rich motifs. - Plant Cell 10: 981-993 (1998).
Zonia, L., Tupý, J., Staiger, C.J.: Unique actin and microtubule arrays co-ordinate the differentiation of microspores to mature pollen of Nicotiana tabacum. - J. Exp. Bot. 50: 581-594 (1999).Zonia, L.: The actin cytoskeleton during differentiation of microspores to mature pollen.
In: Actin: A Dynamic Framework for Multiple Plant Cell Functions. Eds. Staiger, C.J., Baluška, F., Volkmann, D., Barlow, P.W. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Pp. 361-371 (2000).Zonia, L., Cordeiro, S., Feijo, J.A.: Ion dynamics and hydrodynamics in the regulation of pollen tube growth. - Sex. Plant Reprod. 14: 111-116 (2001).
Zonia, L., Cordeiro, S., Tupý, J., Feijo, J.A.: Oscillatory chloride efflux at the pollen tube apex has a role in growth and osmoregulation and is targeted by inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate. - Plant Cell 14: 2233-2249 (2002).Zonia, L., Feijo, J.A.: State and spectral properties of chloride oscillations in pollen. - Biophys. J. 84(2): xxx-xxx, (2003).
5.12. Regulace buněčného dělení auxiny
Eva Zažímalová a kol.
Dva typy rostlinných hormonů - auxiny a cytokininy - spolu tvoří velmi důležitý regulační systém podílející se na řízení základních procesů vývoje rostlin, tedy buněčného dělení, růstu a diferenciace. U rostlinných buněk kultivovaných in vitro jsou auxiny spolu s cytokininy v podstatě jedinými hormony regulujícími jejich růstový cyklus.
V naší práci jsme se soustředili na fyziologicky dobře definovaný modelový materiál (buněčná kultura tabáku závislá na auxinech a nezávislá na cytokininech) a popsali jsme zde působení auxinů z hlediska regulace jejich hladin, jejich transportu, příjmu a přenosu jimi nesených signálů. Prokázali jsme, že auxiny v kultivačním mediu zde plní funkci jakéhosi "aktivátoru buněčného dělení". Zjistili jsme však, že ani částečné ani úplné "auxinové hladovění" nevede k úplnému zastavení buněčného dělení. Buňky jsou totiž schopny kompenzovat nedostatek externího (syntetického) auxinu zvýšenou produkcí auxinu nativního, a to především v exponenciální fázi růstu. Zjistili jsme též, že snížení externí hladiny auxinů vede k podstatnému zvýšení interního obsahu cytokininů, a to především ve formě volného, biologicky velmi aktivního isopentenyladeninu. Důležitost přesného "nastavení" interní hladiny auxinu pro standardní průběh buněčného dělení jsme potvrdili studiem přenašečů auxinu a popsali jsme změny v aktivitě přenašeče auxinů z buňky ve vztahu k nástupu buněčného dělení. Buněčné dělení, na rozdíl od buněčného růstu, zde probíhá pouze tehdy, pokud interní hladina auxinů nepřesáhne určitou kritickou hodnotu. Na základě použití specifického inhibitoru přenašeče auxinů z buňky (viz obr.) jsme navrhli možný mechanismus regulace orientace (polarity) buněčného dělení, založený na cílené lokalizaci tohoto přenašeče v určité oblasti plasmatické membrány.
Obr.: Účinek specifického inhibitoru polárního transportu auxinů, kyseliny 1-N-naftylftalamové (NPA), na fenotyp buněčné linie tabáku VBI-0 (9 dní od počátku subkultivace).
a. Buňky kultivované ve standardním růstovém mediu.
b. Buňky kultivované ve standardním růstovém mediu s přídavkem NPA v koncentraci 10 µM.
Úsečka odpovídá 50 µm.
Zažímalová, E., Opatrný, Z., Březinová, A., Eder, J.: The effect of auxin starvation on the growth of auxin-dependent tobacco cell culture: dynamics of auxin reception and endogenous free IAA content. -J. Exp. Bot. 46: 1205-1213 (1995).
Zažímalová, E., Březinová, A., Holík, J., Opatrný, Z.: Partial auxin deprivation affects endogenous cytokinins in an auxin-dependent, cytokinin-independent tobacco cell strain. - Plant Cell Rep. 16: 76-79 (1996).
Zažímalová, E., Březinová, A., Petrášek, J.: Putative auxin receptors and their possible role in plant development. - Acta Universitatis Carolinae - Biologica 41: 259-272 (1997).
Petrášek, J., Elčkner, M., Morris, D.A., Zažímalová, E.: Auxin efflux carrier activity and auxin accumulation regulate cell division and polarity in tobacco cells. - Planta 216: 302-308 (2002).
Zažímalová, E., Napier, R.: Points of regulation for auxin action. - Plant Cell Rep., v tisku, (2003).
5.13. Úloha polyaminů v růstu a vývoji rostlin
Milena Cvikrová a kol.
Růst a vývoj je výsledkem koordinace buněčného dělení a dlouživého růstu, pochodů s odlišným požadavkem na obsah fytohormonů, zejména auxinu a cytokininů. Mezi látky s hormonálními účinky jsou v současné době řazeny i polyaminy (putrescin, spermidin a spermin), které se vyskytují ve všech živých organismech. Tyto nízkomolekulární látky s kladným elektrickým nábojem se účastní širokého spektra fyziologických pochodů spojených s buněčným dělením, růstem a diferenciací (indukce kvetení, zakořeňování, somatická embryogeneze a vývoj somatických embryí). Významná úloha polyaminů byla potvrzena při reakci rostlin na stresy. Jejich biologická aktivita je do značné míry podmíněna jejich interakcí s biomembránami a molekulami nukleových kyselin, které jsou těmito vazbami stabilizovány a chráněny před degradací.
Vypracovali jsme systém, který nám umožnil srovnání cytologických změn explantátů vojtěšky kultivovaných na médiích indukujících jednak intenzivní buněčné dělení anebo výrazné prodlužování buněk s omezeným počtem dělících se buněk v explantátu. Výsledky ukázaly, že určité polyaminy se podílí na určitých vývojových pochodech. Vysoká hladina spermidinu a sperminu je pravděpodobně nezbytná pro vývoj globulárních proembryogenních struktur v intenzivně se dělícím explantátu, zatímco vyšší podíl putrescinu byl charakteristický pro prodlužující se buňky. Další experimenty prokázaly účast spermidinu na iniciaci a vývoji somatických embryí dubu. Pro potvrzení přímé účasti spermidinu na buněčném dělení jsme se zaměřili na studium obsahu polyaminů v průběhu buněčného cyklu. Změny v obsazích polyaminů korelovaly s určitými fázemi buněčného cyklu. Získané výsledky naznačují souvislost mezi replikací DNA a metabolismem spermidinu a rozšiřují poznatky o úloze polyaminů v regulaci růstu a vývoje rostlin.
Cvikrová, M., Malá, J., Eder, J., Hrubcová, M., Vágner, M.: Abscisic acid, polyamines and phenolic acids in sessile oak somatic embryos in relation to their conversion potential. - Plant Physiol. Biochem. 36: 247-253 (1998).
Cvikrová, M., Binarová, P., Cenklová, V., Eder, J., Macháčková, I.: Reinitiation of cell division and polyamine and aromatic monoamine levels in alfalfa explants during the induction of somatic embryogenesis. - Physiol. Plant. 105: 330-337 (1999).
Cvikrová, M., Binarová, P., Eder, J., Vágner, M., Hrubcová, M., Zoń, J., Macháčková, I.: Effect of inhibition of phenylalanine ammonia lyase activity on growth of alfalfa cell suspension culture: Alterations in mitotic index, ethylene production, and contents of phenolics, cytokinins, and polyamines. - Physiol. Plant. 107: 329-337 (1999).
Havlíčková, H., Cvikrová, M., Eder, J: Polyamine accumulation in ears of winter wheat cultivars infested by Sitobion avenae (F.). - Z. PflKrankh. PflSchutz., 107, 505-513 (2000).
Cvikrová, M., Malá, J., Hrubcová, M., Eder, J., Zoń, J.,Macháčková, I.: Effect of inhibition of biosynthesis of phenylpropanoids on sessile oak somatic embryogenesis. - Plant Physiol. Biochem. 41: v tisku, (2003).
Cvikrová, M., Binarová, P., Cenklová, V., Eder, J., Doležel, J., Macháčková, I.: Effect of 2-aminoindan-2-phosphonic acid on cell cycle progression in synchronous meristematic cells of Vicia faba roots. - Plant Science, přijato k publikaci (2003).
5.14. Organizace aktivních ribozomálních genů v jadérku
Raška, I., Koberna, K., Pliss, A., Večeřová, J., Mašata, M., Malínský, J., Fialová, M., Bednár, J., Štulík, J. Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha Otázka organizace aktivních ribozomálních genů v jadérku živočišných buněk byla od poloviny osmdesátých let předmětem zásadního sporu ve světovém písemnictví. Naše práce z poslední doby umožnily zodpovědět tuto otázku jednoznačným způsobem. Ukázali jsme na světelněmikroskopické a elektronmikroskopické úrovni lze detailně analyzovat jadérka HeLa buněk a zmapovalijsme ribozomální geny jak přímo, pomocí hybridizace in situ, tak nepřímo, pomocí vizualizace nascentních transkriptů. Na světelné úrovni byly ribozomální geny lokalizovány do 10 až 40 jaderných fluorescenčních ohnisek, přičemž většina ohnisek byla transkripčně aktivní. Prokázali jsme, že každé ohnisko pozorované ve světelném mikroskopu odpovídá komplexu fibrilárního centra (FC) spolu s obepínajícími denzními fibrilárními komponentami (DFC). Současně jsme u této jadérkové struktury o velikosti do 0,3m prokázali, že moderní světelná mikroskopie ve spojení s restorací (dekonvolucí) obrazu vede k získání zavádějících výsledků a že použití dekonvolučních algoritmů je nutné kriticky analyzovat u biologických struktur, jejíchž velikosti se blíží rozlišovací schopnosti světelného mikroskopu. Elektronmikroskopické nálezy umožnily identifikovat DFC jako místa syntézy rRNA, což také odpovídá přítomnosti ribozomálních genů v DFC. Vysoký transkripční signál v DFC a na hranici mezi DFC a FC sestával výlučně ze shluků zlatých partikulí. Právě takový signál odpovídá přítomnosti tzv. vánočních stromečků asociovaných s jednotlivými aktivními ribozomálními geny. Stereologická analýza transkripčního signálu ukázala, že "vánoční stromečky" jsou prostorově zkrouceny a vykazují faktor kompaktace 4,0 až 5,5.Koberna, K., Pliss, A., Večeřová, J., Mašata, M., Malínský, J., Fialová, M., Bednár, J., Raška, I.: Ribosomal genes in focus: New transcripts label the dense fibrillar components and form clusters indicative of "Christmas" trees. - J. Cell Biol., 157: 743-748 (2002).
Malínský, J., Koberna, K., Bednár, J., Štulík, J., Raška, I.: Searching for active ribosomal genes in situ: light microscopy in light of the electron beam. - J. Struct. Biol., 110: 227-231 (2002).
5.15. Zpětnovazební mechanismy ve sluchovém systému a jejich plasticita
J. Syka, R. Druga, J. Popelář, N. Rybalko, F. Nwabueze-Ogbo, J. Mazelová, Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha
Sluchová dráha savců obsahuje kromě vzestupných spojů také četné sestupné nervové svazky, které modulují činnost níže ležících etáží ve sluchovém systému. Elektrofyziologické, histochemické a behaviorální metodiky byly využity při sledování funkce sestupných nervových svazků ve sluchové dráze potkana. Léze a kompletní ablace sluchové kůry vyvolaly změny v aktivitě mediátorů (oxid dusnatý) v převodním sluchovém jádře středního mozku - colliculus inferior, dále změny v některých parametrech elektrických odpovědí nervových buněk téže struktury (prodloužení latencí vyvolaných odpovědí a modulaci pozdní fáze neuronové odpovědi) a způsobily zhoršení schopnosti operovaného zvířete rozeznat pauzu v kontinuelně přítomném zvuku. Jednotlivé zpětnovazební okruhy ve sluchovém systému jsou vzájemně funkčně propojeny, jak prokázaly výsledky pokusů, ve kterých se na základě elektrické stimulace colliculus inferior podařilo změnit parametry funkce vnitřního ucha (t.zv. otokaustické emise). Nervový systém je však vybaven opravnými mechanismy s možností plasticity, neboť většina výše uvedených změn byla přítomna jen dočasně po korové lézi a po určité době se sluchové funkce opět stabilizovaly.
Druga, R., Syka, J.: Effect of auditory cortex lesions on NADPH-diaphorase staining in the inferior colliculus of rat. - NeuroReport 12: 1555-1559 (2001).
Nwabueze-Ogbo, F.C., Popelář, J., Syka, J.: Changes in the acoustically evoked activity in the ferior colliculus of the rat after functional ablation of the auditory cortex. - Physiol. Res. 1: S95-S104 (2002).
Syka, J., Rybalko, N., Mazelová, J., Druga, R.: Gap detection threshold in the rat before and after auditory cortex ablation.- Hearing Res. 172: 151-159 (2002).
Popelář, J., Mazelová, J., Syka, J.: Effects of electrical stimulation of the inferior colliculus on 2f1-2f2 distortion product otoacoustic emissions in anaesthetized guinea pigs. - Hearing Res. 170: 116-126 (2002.)
Syka, J.: Plastic changes in the central auditory system after hearing loss, restoration of function and during learning. - Physiological Reviews 82: 601-636 (2002).
5.16. Molekulární mechanismy regulující proliferaci a diferenciaci kmenových a nádorových buněk
Dvořák, P., Ešner, M., Pacherník, J., Hampl, A., Bryja, V., Preclíková, H., Krejčí, P., Faitová, J., Laurell, H. Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha
S využitím modelu tzv. embryoidních tělísek, trojrozměrných struktur připomínajících časná embrya, byla prokázána klíčová úloha přenosu mitogenních signálů fibroblastových růstových faktorů (FGF) receptorem pro fibroblastové růstové faktory 1 (FGFR-1) v embryonální specifikaci viscerálního entodermu. Ve studii byly pro tvorbu embryoidních tělísek a jejich diferenciaci použity myší embryonální kmenové buňky s cíleně inaktivovaným genem pro FGFR-1 a prototypový člen rodiny FGF, FGF-2. Byl navržen originální postup neurální diferenciace embryonálních kmenových buněk in vitro. Práce přichází s jednoduchým přístupem který nevyžaduje obvyklou tvorbu trojrozměrných embryoidních tělísek, obsahujících velký počet různých buněčných typů, a kultivaci buněk s kyselinou retinovou. U myších embryonálních karcinomových buněk byly popsány významné změny exprese proteinu p27, cyklinu D2 a cyklinu D3, které nejsou závislé na stádiu buněčného cyklu. Bylo poprvé poukázáno na souvislost mezi regulovanou expresí proteinu p27 a diferenciací embyonálních karcinomových buněk. Na reprezentativním panelu buněčných linií odvozených z různých typů lidských leukemií byla analyzována exprese molekulárních forem FGF-2. U většiny analyzovaných linií byly nalezeny výrazně zvýšené hladiny FGF-2, a to zejména těch forem, které jsou lokalizovány do buněčných jader a mají výrazně transformační úlohu. Na základě řady funkčních analýz byly vybrané buněčné linie navrženy jako model pro budoucí studia transformační úlohy FGF-2 v nádorových onemocněních hematopoetického systému.
Ešner, M., Pacherník, J., Hampl, A., Dvořák, P.: Targeted disruption of fibroblast growth factor receptor 1 blocks maturation of visceral endoderm and cavitation in mouse embryoid bodies. - Int.J.Dev.Biol. 46:817-825 ( 2002).
Pacherník, J., Ešner, M., Bryja, V., Dvořák, P., Hampl, A.: Neural differentiation of mouse embryonic stem cells grown in monolayer. Reprod.Nutr.Dev., 42:317-326 (2002).
Preclíková, H., Bryja, V., Pacherník, J., Dvořák, P., Hampl, A.: Early cycling-independent changes to p27, cyclin D2, and cyclin D3 in differentiating mouse embryonal carcinoma cells. - Cell Growth & Differentiation, 13:421-430 ( 2002).
Krejčí, P., Faitová, J., Laurell, H., Hampl, A., Dvořák, P.: FGF-2 expression and its action in human leukemia and lymphoma cell lines. - Leukemia ( in press).
5.17. Interakce v reakčních centrech fotosystému II
Vácha, F., Durchan, M., Šiffel, P., Zehetner, A., Scheer, H.
Fotosystém II je klíčovou součástí procesu přeměny sluneční energie na energii chemické vazby nazývaného fotosyntéza. Primárním procesem ve fotosystému II je světlem indukované rozdělení náboje, které v reakčním centru fotosystému II (RC PSII) zajišťuje 6 molekul fotosyntetického barviva chlorofylu spolu se 2 molekulami feofytinu. Existují dva modely absorpce energie světelného záření a její distribuce v RC PSII: (1) dimer chlorofylu, na kterém dochází k rozdělení náboje, ostatní chlorofyly zůstávají stranou tohoto procesu, (2) multimerní uspořádání molekul chlorofylu v RC PSII, které počítá se zapojením jak chlorofylu, tak feofytinu v procesech rozdělení náboje.
Ke studiu excitonové interakce mezi pigmenty RC PSII jsme využili jednak metod cirkulárního dichroismu, které jsou velmi citlivé na vzájemnou interakci mezi molekulami pigmentů, jednak námi vyvinutou metodu izolovaných RC PSII s různým počtem navázaných molekul chlorofylu. Dále jsme připravili RC PSII, u kterých byl hořčík v molekule chlorofylu vyměněn za nikl, což způsobuje zhášení absorbované energie.
Zjistili jsme: (1) energie světelného záření je rozložena přes čtyři molekuly chlorofylu v jádře RC PSII, nikoli však přes molekuly dvou feofytinů. To podporuje představu multimerního modelu, avšak jasně vylučuje molekuly feofytinu z tohoto uspořádání. (2) Během redukce feofytinu dochází ke konformačním změnám na molekule bílkoviny RC PSII, které slouží pravděpodobně ke stabilizaci rozděleného náboje ve fotosystému II. (3) Dvě tzv. vnější molekuly chlorofylu v RC PSII sice mohou přenášet energii světelného záření do jádra RC PSII, avšak zpětný přenos je minimální.
Vácha, F., Durchan, M., Šiffel, P.: Excitonic interactions in the reaction centre of photosystem II studied by using circular dichroism. - Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics 1554: 147-152 (2002).
Zehetner, A., Scheer, H., Šiffel, P., Vácha, F.: Photosystem II reaction center with altered pigment-composition: reconstitution of a complex containing five chlorophyll a per two pheophytin a with modified chlorophylls. - Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics 1556: 21-28 (2002).
5.18. Nový membránový protein bílých krvinek (NTAL) uplatňující se v přenosu signálu do nitra buňky
Imunitní systém je tvořen několika druhy bílých krvinek. Ty mají na svém povrchu celou řadu různých tzv. receptorových molekul, pomocí kterých dostávají informace o tom, kdy a jak je potřeba začít bojovat proti škodlivým mikroorganismům. Přenos signálů od receptorů do nitra buňky je velmi komplikovaný proces, na kterém se podílejí desítky různých proteinových molekul. Naší skupině se podařilo objevit jeden úplně nový signalizační protein, který byl v uplynulých letech neúspěšně hledán v několika předních světových laboratořích jako "chybějící článek" v signalizačních dějích spouštějících tvorbu protilátek buňkami zvanými B lymfocyty. Naše výsledky dosažené ve spolupráci s několika dalšími českými a zahraničními laboratořemi ukazují, že tento nový protein nazvaný zkratkou NTAL (non-T activation linker) je možná ještě důležitější pro normální funkci jiných druhů bílých krvinek, jejichž hlavním úkolem je pohlcování a ničení mikroorganismů. Tato práce klade základy k dalším, nyní rozpracovaným studiím, které by mohly přispět k objasnění příčin některých poruch imunitního systému (alergie, určité typy imunitních nedostatečností).
Brdička T., Imrich M., Angelisová P., Brdičková N., Horváth O., Špička J., Hilgert I., Lusková P., Dráber P., Novák P., Engels N., Wienands J., Simeoni L., Osterreicher J., Aguado E., Malissen M., Schraven B., Hořejší V.: NTAL (Non-T cell activation linker): a transmembrane adaptor protein involved in immunoreceptor signaling. J.Exp.Med. 196, 1617-1626, 2002
5.19. Aktivace genu twist se podílí na vzniku nádorů ledvin - nefroblastomů
Kuřecí ledvinné nádory - nefroblastomy, vyvolané retrovirem MAV2, jsou uznávaným modelem pro studium nádorové transformace nefrogenního blastému. Očekává se, že tento model přinese informace významné pro pochopení vzniku Wilmsových tumorů - zhoubných nádorů ledvin u dětí. Podle současného stavu znalostí vznikne nefroblastom po tom, co dojde k deregulaci určité (dosud neznámé) sady genů. V kuřecím modelu je tato deregulace vyvolána integrací retrovirových genomů, u lidských nádorů mutací genů. V uvedeném článku jsme zjistili na kuřecím modelu, že jedním z těchto deregulovaných genů je gen twist. Bílkovina Twist je transkripční faktor, který se podílí na regulaci vývoje nezralých buněk mezodermálního původu a jeho deregulací je zřejmě udržován nebo posílen embryonální charakter nefrogenních buněk a zvýšena jejich odolnost k signálům navozujícím buněčnou smrt. Uvedený výsledek je naším prvním krokem k určení dalších genů, které tvoří úplnou "nádorovou sadu". Dlouhodobým cílem práce je prostřednictvím kuřecího experimentálního modelu, přispět k pochopení genetických změn, způsobujících vznik lidských Wilmsových nádorů.
Pajer P., Pečenka V., Karafiát V., Králová J., Hořejší Z. and Dvořák M.: The TWIST gene is a common target of retroviral integration and transcriptional deregulation in experimental nephroblastoma. Oncogene, v tisku.
5.20. Využití genomiky pro studium endogenních i infekčních retrovirů
Znalost struktury lidského genomu umožňuje, mimo jiné, studovat lidské endogenní retroviry (HERV) a jiné elementy, které jsou v genomu zastoupeny v mnoha kopiích a které se množí reversní transkripcí a začleněním do nových míst na chromosomech. Sestavili jsme databázi lidských endogenních retrovirů (HERVd na adrese http://herv.img.cas.cz), která umožňuje klasifikaci jednotlivých HERV a mapování jejich polohy v genomu3. S využitím této databáze jsme studovali jednu z několika rodin HERV a nalezli jsme četné atypické kopie (procesované pseudogeny) vzniklé aktivitou jiných genomových parasitů - LINE11. Toto je nově poznaný mechanismus, který může velmi podstatným způsobem přispívat k plasticitě genomu. Ukázali jsme, že převážná většina těchto pseudogenů je velmi krátká a dosavadními přístupy nedete-kovatelná, takže jejich zastoupení v lidském genomu je dosud velmi podhodnocováno4. Lokalisovali jsme rovněž místa v genomu, kam se přednostně začleňují kopie infekčního viru HIV-1. Jsou to geny a chromosomální oblasti bohaté na geny2. Naše výsledky jsou zajímavé jednak z hlediska struktury a evoluce genomu, jednak proto, že retroviry se používají jako vektory pro genovou terapii. Recentní případ leukemie po genové terapii precipitoval velký zájem právě o preferenční integraci a možnost zacílení retrovirových vektorů.
1. A. Pavlíček, J. Pačes, D. Elleder, J. Hejnar.: Processed pseudogenes of human endogenous retroviruses generated by LINE1: their integration, stability, and distribution. Genome Res. 12: 391-399, 2002.
2. D. Elleder, A. Pavlíček, J. Pačes, J. Hejnar.: Preferential integration of human immunodeficiency virus type 1 into genes, cytogenetic R bands and GC-rich regions: insight from the human genome sequence. FEBS Lett. 517: 285-286, 2002.
3. J. Pačes, A. Pavlíček, V. Pačes.: HERVd: database of human endogenous retroviruses. Nucleic Acids Res. 30: 205-206, 2002.
4. A. Pavlíček, J. Pačes, R. Zíka, J. Hejnar.: Length distribution of long interspersed nuclear elements (LINEs) and processed pseudogenes of human endogenous retroviruses: implications for retrotransposition and pseudogene detection. Gene 300: 189-194, 2002
5.21. Bakterie produkující butyrát v trávicím traktu přežvýkavců - pomocníci produkující antikancerogenní látky
Na základě sekvencí 16S DNA se ví, že více než 60-80% bakterií v trávicím traktu obratlovců je z taxonomického hlediska nepopsaná, neznámá, doposud nekultivovaná nebo dokonce nekultivovatelná. Významnou součást těchto populací tvoří produkující bakterie butyrát. Izolovali jsme a popsali dva nové druhy těchto bakterií a sice Butyrivibrio hungatei sp. nov. a Pseudobutyrivibrio xylanivorans sp. nov., ze skupiny gram positivních bakterií, tedy klostridií, které u přežvýkavců představují dominantní část bakteriální populace produkující butyrát a význačně se podílejí na degradaci rostlinných polysacharidů. Vedle toho je B. hungatei v předžaludcích přežvýkavců pravděpodobně hlavním producentem konjugované kyseliny linolové (CLA). CLA vykazuje překvapivě význačné antikarcinogenní vlastnosti, redukuje koncentraci nízko koncentrovaných lipoproteinů v plazmě a zabraňuje tak vzniku atherosklerosy. Podílí se také význačně na modulaci imunitního systému. Tím výrazně ovlivňuje biologickou hodnotu potravin. Pro detekci a kvantifikaci butyrivibrií v trávenině jsme vyvinuli metodu založenou na kompetitivní PCR.
Kopečný, J., Zorec, M., Mrázek, J., Kobayashi, Y., Marinšek-Logar, R.: Butyrivibrio hungatei sp. nov., and Pseudobutyrivibrio xylanivorans sp. nov., butyrate-producing bacteria from the rumen. - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 23: 000 - 000 (2003).
On-line: DOI 10.1099/ijs.0.02345-0, 2002.Mrázek, J., Kopečný, J.: Development of competitive PCR for detection of Butyrivibrio fibrisolvens isolates. - Folia Microbiologica 46: 63-65 (2001).
5.22. Biodiverzita středoevropských ryb je větší než se předpokládalo - molekulární biologie jako účinný nástroj ochrany biologické rozmanitosti
Přestože jsou evropské sladkovodní ryby předmětem vědeckého studia již déle než čtyři a půl století, jejich vývojové vztahy jsou nedostatečně prostudovány a jejich skutečná druhová početnost není zdaleka známa. Nevyhnutelným důsledkem tohoto stavu je chaos, ve kterém se nachází nejen systematika mnoha skupin, ale v praktické rovině i ochrana jejich populací. Obohacení nástrojů pro studium biologické rozmanitosti o nové metody na úrovni DNA umožnilo rekonstrukci vývojových vztahů a klasifikaci ryb s dosud nebývalou přesností. Porovnání sekvencí mitochondriální DNA různých populací parmy Petényovy (Barbus petenyi) z Karpat a z Dinárského a Balkánského pohoří mezi sebou a s ostatními druhy početného rodu Barbus ukázalo, že jménem tohoto druhu jsou souhrnně označovány tři velmi odlišné vývojové linie třetihorního stáří. Existence této mitochondriální divergence je podpořena výsledky studia vlastností jaderného genomu a je důvodem k popisu dvou nových druhů - parmy karpatské (Barbus carpathicus) a parmy balkánské (Barbus balcanicus). Tento příklad ukazuje, že pro vědecky podloženou ochranu populací evropských sladkovodních ryb, stejně jako pro poznání jejich skutečné biodverzity, je použití molekulárně-genetických znaků zcela klíčové.
Kotlík, P., Berrebi, P.: Genetic subdivision and biogeography of the Danubian rheophilic barb Barbus petenyi inferred from phylogenetic analysis of mitochondrial DNA variation. - Molecular Phylogenetics and Evolution 24: 10-18 (2002).Tsigenopoulos, C.S., Kotlík P., Berrebi P.: Biogeography and pattern of gene flow among Barbus species (Teleostei: Cyprinidae) inhabiting the Italian Peninsula and neighbouring Adriatic drainages as revealed by allozyme and mitochondrial sequence data. - Biological Journal of the Linnean Society 75:83-99 (2002).Kotlík, P., Tsigenopoulos, C.S., Ráb, P., Berrebi, P.: Two new Barbus species from the Danube River basin, with redescription of B. petenyi (Teleostei: Cyprinidae). - Folia Zoologica 51:227-240 (2002).
5.23. Nové poznatky o mechanismu zrání savčích oocytů a možnosti jeho ovlivnění
Detailní poznání procesů probíhajích v savčím vajíčku před oplozením, v jeho průběhu a v ranných fázích jeho vývoje po oplození patří ke zcela zásadním tématům vývojové biologie a má bezprostřední vztah k rozvoji celé oblasti klonování a genetického inženýrství. Změny translace během zrání bovinních oocytů jsou korelovány se změnami exprese a fosforylace tzv. translačního iniciačního faktoru eIF4E a jeho vazebného proteinu 4E-BP1, klíčového bodu procesu. Exprese eIF4E zůstává na stabilní úrovni během celého průběhu zrání, avšak dochází k výraznému nárůstu jeho fosforylace jak ve stádiu metafáze I, tak metafáze II. Nemění se rovněž množství vazebného proteinu 4E-BP1, avšak dochází ke zvýšení jeho vazby na eIF4E v průběhu zrání oocytů. Že tento proces lze experimentálně ovlinit, ukazuje použití specifických inhibitorů řídích enzymů buněčného cyklu (cdc2- a MAP kináz) Butyrolactonu I a PD 98059. Znalost těchto mechanismů na modelu bovinních oocytů přináší zásadní příspěvek k poznání mechanismů buněčného zrání obecně a mají přímý dopad v biomedicíně.
Tomek, W., Sterza, F.A., Kubelka, M., Wollenhaupt, K., Torner, H., Anger, M., Kanitz, W.: Regulation of translation during in vitro maturation of bovine oocytes: the role of MAP kinase, eIF4E (cap binding protein) phosphorylation and 4E-BP1. - Biol.Reprod. 66:1274-1282 (2002).
