Laboratoře pro strukturní biologii a metabolomiku

Vědci v areálu biologických a lékařských pracovišť AV ČR mají od 14. ledna 2013 k dispozici špičkové technologie pro výzkum medicínsky důležitých molekul s ohledem na včasnou detekci závažných onemocnění a lepší porozumění jejich mechanismům. V pražské Krči byl totiž zahájen projekt Pražská infrastruktura pro strukturní biologii a metabolomiku – PISBM, který Mikrobiologický ústav AV ČR realizoval v rámci 4. výzvy OP Praha – Konkurenceschopnost.

Všechna fota: Stanislava Kyselová, Akademický bulletin
Iontová cyklotronová rezonance s indukcí magnetického pole 12 Tesla

Unikátní zařízení využijí také další vědecká pracoviště z České republiky i zahraničí. Mezi oficiální partnery Pražské infrastruktury patří Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Univerzita Palackého v Olomouci a Univerzita Karlova v Praze, které chtějí spolupracovat při řešení klíčových biomedicínských otázek – a to s důrazem na diagnostiku infekčních a nádorových onemocnění a definici příslušných terapeutických cílů.
V nové infrastruktuře byly instalovány tři vysoce moderní přístroje – spektrometr jaderné magnetické rezonance (NMR) s protonovou pozorovací frekvencí 700 MHz (indukce magnetického pole 16,4 Tesla), hmotnostní spektrometr s iontově cyklotronovou rezonancí (FTMS) s indukcí magnetického pole 12,0 Tesla a rovněž byl rozšířen stávající NMR spektrometr 600 MHz o spojení s kapalinovou chromatografií, extrakcí na pevné fázi a hmotnostním spektrometrem (HPLC-SPE-NMR-MS).
Slavnostnímu otevření předcházela 90minutová konference pro odbornou veřejnost a novináře, která definovala nové možnosti a cíle vytvořeného pracoviště. V jejím úvodu vystoupil ředitel MBÚ dr. Martin Bilej s ohlédnutím za dlouhou historií výzkumu molekulárních struktur v tomto ústavu; vzpomněl klíčové osobnosti, jež v ústavu v posledních 45 letech v této oblasti působily, a to zvláště dr. Zdenko Vaňka (sektor biogeneze přírodních látek), dr. Jiřího Ludvíka (elektronová mikroskopie) a Petra Sedmeru (jaderná magnetická rezonance). Mikrobiologický ústav byl i prvním pracovištěm v zemích bývalého východního bloku, které instalovalo iontový cyklotron (2004); na zařízení byly následně zavedeny do praxe mnohé pionýrské techniky. V oblasti hmotnost­ního zobrazování vyvinuli zdejší vědci techniky analýzy obtížně měřitelných tkání, jako jsou plíce myší, těla hmyzu nebo prasečí či lidské oční čočky. Dále byly ­vyvinuty počítačové programy pro identifikaci lipidů v těchto vzorcích a též se podařilo charakterizovat biomarkery některých infekčních nebo dědičných onemocnění. Úspěch představují i metody obohacení biologicky významných, ale vzácně se vyskytujících fosfopeptidů ve složitých směsích proteinů; jde o důležité molekuly buněčné signalizace.

Ředitel MBÚ Martin Bilej a členové Akademické rady Vladimír Mareček a Miroslav Flieger otevírají nové pracoviště; v pozadí NMR spektrometr.

Vedoucí Laboratoře charakterizace molekulární struktury MBÚ prof. Vladimír Havlíček shrnul přínos nové infrastruktury české vědě a zdůraznil nástup moderních odvětví, tedy technik hmotnostně spektrometrického zobrazování, chemického zesítění, vodík-deuteriové výměny a metabolomických aplikací inovativní kombinační technikou HPLC-SPE-NMR-MS. Pozornost hmotnostně-spektrometrickým technikám strukturní biologie a jaderné magnetické rezonanci věnují badatelé především proto, že uvedené metody reflektují situaci v kapalném skupenství – jsou tedy blíže biologickým podmínkám, než je tomu u rentgenové difrakce. Extrémní rozlišení hmotnostní spektrometrie (řádově v milionech), které je nyní k dispozici, umožňuje přímé sledování méně běžných přirozených izotopů. Tím je informace o elementárním složení měřených látek víceméně nezpochybnitelná. Přístroje jsou rovněž velmi citlivé (stanovení koncentrací v řádu desítek attomolů) a přesné (určení hmotnosti v řádu ppb). S vyšším polem je získán i lepší dynamický rozsah analýzy, což platí pro MS i NMR. Prezentována byla dále data vícerozměrných korelací z nového NMR spektrometru dvojitě izotopicky značené (¹⁵N,¹³C) bílkoviny NKR-P1C a rovněž první lednová data, která vědci získali technikou HPLC-SPE-NMR-MS. U tohoto přístroje hraje zásadní roli robotika. Po separaci vzorků kapalinovou chromatografií se vzorek dělí. Menší část oddělené látky absolvuje kvalitativní hmotnostně-spektrometrickou analýzu; větší část je sorbována na extrakci tuhou fází (SPE), z níž je vzorek vymyt do NMR kyvety pro následné jedno- nebo vícerozměrné experimenty. Sběr na SPE kolonku lze opakovat a vzorek tak dostatečně zakoncentrovat. Uvedený způsob sběru dat je jen jednou z více variant, jak HPLC-SPE-NMR-MS pracuje. Velké naděje pracovníci vkládají do metabolomických možností této analytické sestavy. Zatímco MS se používá k identifikačním účelům, NMR slouží jako kvantitativní detektor. Tímto způsobem se lze vyhnout stávající praxi, kdy se každá skupina metabolitů musí pro hmotnostně-spektromet­rická kvantitativní stanovení zvlášť kalibrovat izotopicky značeným standardem.
Posluchači si dále vyslechli Arnda Ingendoha (Bruker Daltonics, Německo) – Modern mass spectrometry: current applications and future perspectives – a Ulricha Braumanna (Bruker Biospin, Německo) – Combination of HPLC with NMR and MS – status and developments. V přednáškách zazněly i mikrobiologické aplikace. Pokrok zaznamenala hmotnostní spektrometrie nejen v rychlém určování mikroorganismů na základě otisku ribozomálních bílkovin; v současnosti se prosazuje také v oblastech určování virulence kmenů a antibiotického nebo antimykotického testování léčiv. NMR spektroskopie se stává rutinní metabolomickou metodou, jež umož­ňuje současně sledovat desítky i stovky metabolitů v lidských tělních tekutinách. Právě tyto aplikace plánují pracovníci Pražské infrastruktury v nově podaných grantových přihláškách.

Posluchači a hosté se následně zúčastnili slavnostního zahájení provozu a prohlédli si vybavenost laboratoří. Vznik Infrastruktury si vyžádal investici ve výši 97 milionů korun, z níž zásadní část představovaly přístroje; menší část stála přístavba dalšího patra na jedné z budov v biologickém areálu v Krči. Vzniklo tak 274 m2 nové plochy a šest dalších institucionálních míst, na něž ústav v nejbližší době vypíše veřejný konkurz. Nová instrumentace poskytuje nový druh a detail informací (přesnost, rychlost, správnost), které lze o strukturách organických látek získat, což dosavadní česká technika neumožňovala (citlivost, rozlišení). Významná je rovněž automatizace procesů – zpracováním vzorku počínaje a sběrem dat konče; Infrastruktuře umožní pracovat 24 hodin denně a sedm dní v týdnu. Přestože badatelé v poslední době dosáhli mnoha úspěchů i v usnadnění interpretace získávaných dat, zůstává tato nejnáročnější část výzkumu doménou vědecké obsluhy přístrojů. Laboratoř charakterizace chemické struktury v současnosti sdružuje 25 vědeckých pracovníků a studentů, kteří tyto úkoly zastávají i na mnoha dalších spektrometrech a mikroskopech. Příští plánovanou investici představuje pořízení skenovacího elektronového mikroskopu s rozlišením v řádu nanometrů. Mikroskop, který umožní zobrazovat hluboce zmražené vzorky, bude instalován na podzim tohoto roku.

VLADIMÍR HAVLÍČEK,
Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.