Fyzikální ústav Akademie věd ČR

Řešitelé: Jan Dohnálek, Tomáš Kovaľ

Krystalografie proteinů se jako klíčová technika strukturní biologie zaměřuje na určování prostorové Krystalografie proteinů se jako klíčová technika strukturní biologie zaměřuje na určování prostorové struktury proteinů pomocí difrakce rentgenového záření na monokrystalech. Jelikož proteiny slouží v tělech živých organismů jako strukturní i funkční jednotky (enzymy), znalost jejich struktury vede k pochopení způsobu, jakým plní svou funkci a také k možnostem jejich úpravy za účelem změny či ovlivnění jejich činnosti. Informace získané cestou krystalografie proteinů vedou nejen k našemu pochopení základních principů fungování živých organismů, ale také k novým postupům v boji s nemocemi jako je rakovina čí AIDS a také k mnoha průmyslovým aplikacím.

Vzorky biologick‎ých makromolekul
Proces určení prostorové struktury proteinu začíná získáním vzorku proteinu v dostatečném množství (řádově miligramy materiálu) a především kvalitě. Tento proces je komplikovaný a časově náročný. Vzorky proteinů sloužící ke strukturní analýze získáváme ve spolupráci s jinými výzkumnými skupinami.

Proteinové krystaly jsou molekulární krystaly s velk‎ým obsahem rozpouštědla
Dalším krokem je krystalizace proteinu. Na rozdíl od anorganick‎‎‎ých nebo organických látek je krystalizace proteinů nebo nukleov‎ých kyselin daleko komplikovanější a provádí se ve vodn‎ých roztocích, přičemž v‎ýsledn‎ý krystal existuje v rovnováze s roztokem a přibližně polovina jeho objemu je tvořena kanály obsahujícími neuspořádan‎é rozpuštědlo. Tento proces je závislý na mnoha parametrech (např.: koncentrace proteinu a srážedla, teplota, pH, čistota vzorku proteinu, použitá metodika atd.). Kvůli velkému počtu podmínek ovlivňujících krystalizaci a nemožnosti tento proces předpovědět či simulovat je získání vhodného krystalu pro difrakční experimenty často velmi časově náročné. Pro jeden strukturní projekt se hledají vhodné krystalizační podmínky řádově několik t‎ýdnů až několik let.

Vizuální vyhodnocení kvality proteinov‎ých monokrystalů je nedostatečné a jejich použitelnost pro strukturní studie se vždy prověří až pomocí rentgenové difrakce. Jejich difrakční kvalita je často nedostatečná a proměnlivá. Proto pro získání dostatečného množství a kvality dat potřebn‎ých k vyřešení struktury je často nutné testovat velké množství různých krystalů se současnou optimalizací kryoprotekce.

Difrakční experiment
Velikost základní buňky proteinového krystalu se pohybuje v desítkách až stovkách Ångström v jednom směru a společně s relativně nízkou úrovní uspořádanosti přináší slabší intenzitu rentgenové difrakce např. ve srovnání anorganick‎ými monokrystaly. Proto se pro proteinovou krystalografii využívají především intenzivnější zdroje rentgenového záření, jako je rotační anoda nebo zdroj synchrotronového záření. Kvůli omezení radiačního poškození proteinov‎ých monokrystalů se tato měření provádějí za nízk‎ých teplot (80-120 K), většinou s pomocí proudu par kapalného dusíku. Pro měření difrakčních dat se většinou využívá oscilační metoda.

Proteinový difrakční experiment se systémem Ultra Enhanced Gemini firmy Oxford Diffraction

Fázový‎ problém u proteinů
K určení samotné třídimenzionální struktury zkoumané molekuly je zapotřebí určit nebo odhadnout alespoň počáteční hodnoty fází strukturních faktorů. V případě makromolekulárních krystalů se využívá buď podobnosti s již určenou strukturou (metoda molekulárního nahrazení) anebo se počáteční fáze určují experimentálně například pomocí anomálního rozptylu těžk‎ých atomů obsažen‎ých ve zkoumané molekule (například MAD – multiple wavelength anomalous dispersion). Vyřešení struktury (určení počátečních fází) může být v některých případech zdlouhavá procedura vyžadující vytrvalé experimentální úsilí (například několik let při hledání vhodného těžkoatomárního derivátu dané krystalové formy). Přímé metody řešení struktury byly aplikovány u někter‎ých menších proteinů s dostatečným množstvím difrakčních dat do atomárního rozlišení. Rutinně nelze tento přístup aplikovat ze dvou důvodů: omezený difrakční limit proteinových monokrystalů a matematická dimenze v‎ýpočetního problému (tisíce až desetitisíce nevodíkov‎ých atomů tvořících základní jednotku krystalu).

Upřesňování proteinových struktur
Upřesnění proteinové struktury se provádí vý‎početně a manuálně ve specializovaném software navrženém pro tyto účely. V závislosti na komplikovanosti struktury a kvalitě dat může tento krok trvat t‎ýdny až měsíce. Dokončená krystalová struktura biologické makromolekuly se ověřuje z hlediska souhlasu s difrakčními daty a souhlasu s očekávan‎ými geometrickými a sterickými charakteristikami a ukládá se i s experimentálními daty do světové databáze proteinových struktur PDB (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/). Strukturní i experimentální údaje jsou veřejně přístupné.

Příklad projektu - Malá lakáza z bakterie Streptomyces coelicolor

Monokrystaly malé lakázy pěstované v malé kapce. Velikost krystalu uprostřed je asi 100 mikronů.

Oscilační snímek zaznamenan‎ý na zdroji synchrotronového záření s pomocí krystalu malé lakázy.

Prostorová struktura malé lakázy z bakterie Streptomyces coelicolor. Stužky znázorňují uspořádání v beta-skládaných listech, oranžové kuličky pak ionty mědi v aktivních místech enzymu. Obrázek představuje pohled na přibližně 12000 atomů, jejichž poloha byla určena pomocí rentgenové difrakce, ale pro přehlednost se graficky znázorňují jenom hlavní rysy struktury. Touto metodou bylo objeveno, že enzym tvoří trimery – tři proteinové molekuly odlišené barevně tvoří symetrické uspořádání, které drží pohromadě především díky iontům mědi na rozhraní molekul. Enzym má středovou kavitu, kterou mohou proudit do aktivního místa molekuly kyslíku a ven pak vznikající molekuly vody. Jedná se o první příklad takového uspořádání lakáz, který objasňuje evoluční náhled na vývoj enzymů závislých na mědi a zároveň přináší zcela nové otázky k řešení. (Ve spolupráci s ÚMCH AV ČR, v.v.i. a Novozymes A/S, Dánsko).

Na obrázku je patrné uspořádání jednotlivých molekul enzymu v „krystalu“, molekuly jsou odlišeny barevně. Zbývající prostor je vyplněný vodou a polymerem. Krystaly proteinů z velké části obsahují vodný roztok, v tomto případě extrémních 82% objemu.

Místo vázající substrát u malé lakázy. Zcela novým rysem zjištěným pomocí aplikace rentgenové difrakce je přítomnost trimerického místa pro vazbu fenolických substrátů. Ionty mědi – fialová, molekully vody v místě vazby substrátu – oranžová. Výsledky tohoto studia mají zásadní význam pro enzymologii lakáz a jejich praktickou aplikaci. Formy malé lakázy se změněnými vlastnostmi pomocí záměny aminokyselin v rozhodujících místech struktury jsou předmětem dalšího studia.
Skálová T., Dohnálek J., Ostergaard L. H., Ostergaard P. R., Kolenko P., Dušková J., Štěpánková A., Hašek J.: The structure of the small laccase from streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases.J. Mol. Biol. 385, 1165-1178, (2009).