Analytické metody - stanovení rostlinných hormonů
Podobně jako v jiných oblastech výzkumu je pokrok poznání hormonálních regulací růstu a vývoje rostlin závislý na zdokonalení existujících a vývoji nových metod výzkumu. Pro tento účel byla v naší laboratoře zřízena samostatná analytická jednotka, která se věnuje zejména rozvoji moderních metod identifikace a stanovení rostlinných hormonů, jakož i sledování dynamiky jejich biosyntézy a metabolických přeměn.
Techniky, které používáme, zahrnují extrakce na tuhou fázi (SPE), vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) a rovněž dvoudimenzionální HPLC (2D-HPLC). Používáme „univerzální“ detektory typu UV-VIS a ELSD, on-line detektor radioaktivity pro metabolické profilování, a hmotnostní spektrometr (MS) pro vysoce selektivní a citlivou detekci, identifikaci a kvantifikaci mnoha analytů.
V naší analytické laboratoři byla vyvinuta rychlá a efektivní metoda extrakce a čištění různých skupin rostlinných hormonů a některých dalších biologicky aktivních látek ze společného výchozího vzorku rostlinného materiálu pro jejich následné kvantitativní stanovení (Dobrev and Kamínek, J. Chrom.A 2002, Dobrev et al., J. Chrom.A 2005 a Hoyerová et al., Phytochemistry 2006). Citlivost a operativnost této metody umožnily její rychlé rozšíření a využití, potvrzené vysokou citovaností výchozí práce (Dobrev and Kamínek, 2002, ocenění: „top cited paper“ in J. Chromatography A).
Profilování a identifikace metabolitů v rostlinách.
Pro urychlení a zpřesnění studia klíčových enzymů zapojených do metabolismu fytohormonů byly zdokonaleny metody stanovení aktivit cytokininoxidázy/dehydrogenázy (Dobrev a Motyka, Biologické Listy 2003), zeatinreduktázy (Gaudinová et al., J. Plant Growth Regul. 2005) a cytokinin glukosyltransferázy (Polanská et al., Biotechnology Letters 2004) a ipt-transferázy.
Laboratoř se též zabývá „metabolickým profilováním“ a stanovením metabolických přeměn značených rostlinných hormonů a dalších biologicky aktivních látek. Příslušné metody jsou rovněž využívány pro stanovení rychlosti příjmu značených látek rostlinnými buňkami, jakož i pro identifikaci neznámých metabolitů (Mravec et al., Nature 2009; Barbez et al., Nature 2012); Hošek et al., Journal of Experimental Botany 2012).
Obecně máme možnost identifikovat a detekovat různé biologicky aktivní látky, zejména fytohormony auxin, kyselinu abscisovou, gibereliny, kyselinu salicylovou, kyselinu jasmonovou, cytokininy, a mnoho jejich prekurzorů a metabolitů v jednom vzorku o velmi malém množství (desítky až stovky miligramů, Djilianov et al., Journal of Plant Growth Regulation 2013; Dobrev and Vankova, Methods in Molecular Biology, 2012; Pinheiro et al., Journal of Experimental Botany 2011).