Činnost Laboratoře biochemie a molekulární biologie zárodečných buněk je zaměřena na problematiku meiotického zrání savčích oocytů, jejich oplodnění a aktivace, stejně tak jako na biochemickou charakterizaci těchto procesů. Jako modelový systém jsou savčí oocyty využívány též pro studium mechanismů uplatňujících se při regulaci buněčného cyklu.
Meiotické zrání savčích oocytů je charakterizováno především počátečním blokem v dictyotenním stádiu první meiotické profáze, který je uvolněn buď působením hormonálního stimulu in vivo nebo spontánně po vyjmutí oocytů z folikulu a následné kultivaci oocytů in vitro. Na počátku zrání jsou oocyty v tzv. stádiu zárodečného váčku s intaktní jadernou membránou („germinal vesicle“, GV–stádium), v dalším průběhu zrání pak dochází k rozpadu jaderné membrány („germinal vesicle breakdown“, GVBD), oocyty procházejí prvním meiotickým dělením a po vyloučení prvního polárního tělíska je jejich vývoj opět zablokován ve stádiu 2. meiotické metafáze (M II) až do oplodnění, popř. aktivaci chemickými či fyzikálními stimuly. Poměrně dlouhá doba celého procesu meiotického zrání (od 12 h u myši až po 44 h u prasete) spolu s velkou mírou synchronizace vývoje oocytů v jednotlivých stádiích činí ze savčích oocytů velice dobrý model pro studium procesů probíhajících během M-fáze buněčného cyklu.
Naše laboratoř se zaměřuje především na studium mechanismů podílejících se na regulaci iniciace meiotického zrání a na molekulární podstatu hlavních morfologických změn, ke kterým dochází v průběhu tohoto procesu (rozpad jaderné membrány, kondenzace chromozomů, tvorba metafázního vřeténka a následná segregace chromozomů).
Byl popsán časový průběh změn v aktivitách dvou nejdůležitějších M-fázích protein kináz (cdk1 kinázy a MAP kinázy) během zrání a aktivace prasečích a bovinních oocytů. Z našich výsledků vyplývá, že k aktivaci obou protein kináz dochází přibližně v době rozpadu zárodečného váčku, GVBD, a zatímco aktivita cdk1 kinázy (která je součástí tzv. M-phase promoting faktoru, MPF) se částečně snižuje na přechodu anafázeI/telofázeI a opět vzrůstá v metafáziII, aktivita MAP kinázy zůstáva na vysoké úrovni až do stádia metafáze II, kde se podílí na MII bloku jako součást tzv. cytostatického faktoru, CSF. Po fertilizaci, či aktivaci oocytů pak dochází k poklesu aktivit obou těchto protein kináz. Dále naše výsledky ukazují, že ani cdk1 protein kináza ani MAP kináza se nepodílí na procesu kondenzace chromozomů v savčích oocytech.
Studovali jsme též možnou úlohu další M-phase specifické protein kinázy Aurory B při reorganizaci chromozomů během meiotického zrání prasečích oocytů, přičemž jsme prokázali, že ani aktivita Aurora B kinázy ani fosforylace histonu H3 jakožto jejího substrátu se neuplatňuje při kondenzaci chromozomů, ale tyto aktivity jsou pravděpodobně důležité pro správné uspořádání chromozomů v dělícím vřeténku a pro separaci chromozomů během anafázeI.

V současné době je také zkoumána úloha protein kinázy B (Akt kináza) při iniciaci meiotického zrání myších a prasečích oocytů. Ukazuje se, že aktivace PKB v myších oocytech je nezbytná pro aktivaci cdk1 kinázy a tudíž znovuzahájení meiózy. PKB v závislosti na fosforylaci na T308 a S473 prodělává dynamickou relokalizaci během meiotického zrání. V oocytu lze identifikovat nejméně dvě prostorově odlišitelné populace, jež se liší svojí lokalizací a fosforylací na T308 a S473. Centrosom (MTOC) během rozpadu jaderné membrány je jediným místem, kde se nachází PKB fosforylovaná jak na T308 tak i S473.
Úloha již výše zmíněné MAP kinázy (Erk1/Erk2), kromě její role při M II bloku jako součásti CSF, nebyla doposud v savčích oocytech dostatečně popsána. Naše současné výsledky ukazují, že Erk1/Erk2 MAP kináza se s největší pravděpodobností podílí na fosforylaci a aktivaci Mnk1 a Mnk2 protein kináz (MAP kinase-interacting kinases 1 and 2), jejichž přímým substrátem je pak translační iniciační faktor eIF4E. V průběhu zrání prasečích oocytů dochází k postupně se zvyšující fosforylaci eIF4E faktoru, stejně tak jako jeho regulačního proteinu, 4E-BP1, na které se podílí mimo jiné i mTOR/FRAP protein kináza. V důsledku těchto fosforylací dochází k vazbě eIF4E na eIF4G a tvorbě aktivního translačního iniciačního komplexu eIF4F. Zatímco je během zrání oocytů tímto způsobem aktivován tzv. „cap-dependentní“ mechanismus iniciace translace, celková úroveň translace se postupně snižuje. V současné době se soustředíme na vysvětlení těchto jevů a to především na zjištění, zda v oocytech převažuje na počátku meiotického zrání „cap-independentní“ mechanismus iniciace translace, či spíše dochází v průběhu zrání k inhibici iniciace translace jiným, nám doposud neznámým způsobem (např. inhibice přes další iniciační faktory, či přes PABP, PAIP1,2 proteiny).

Proteomová skupina Laboratoře biochemie a molekulární biologie zárodečných buněk se soustředí na globální analýzu proteomu oocytů v průběhu meiotického zrání s využitím klasického přístupu (dvojrozměrná elektroforéza a hmotnostní spektrometrie). Úvodní studie ukázala na dominantní zastoupení redox regulujících proteinů v oocytu (37% z celkového počtu dosud identifikovaných proteinů) a neobvykle vysokou hladinu dalších proteinů, např. C-terminální ubiquitin hydrolázy L1. Další práce je zaměřena na fosforylace proteinů, tzv. fosfoproteomy oocytů v průběhu meiotického zrání jako jemného regulačního mechanismu, který kontroluje celý proces.
V rámci studia mechanismů uplatňujících se při regulaci buněčného cyklu využíváme proteomiku k analýze biochemického podkladu anti-proliferačních a anti-mitotických účinků inhibitorů cyklin-dependentních kináz, které patří mezi potenciální novou generaci protinádorových preparátů. Naše výsledky ukázaly, že působení inhibitorů cyklin-dependentních kináz může byt spojeno s epigentickou regulaci na úrovni chromatinové struktury.
Nedávno byla ustavena Společná laboratoř pro proteomovou analýzu (http://pf2d.science-research.net) zahrnující naši laboratoř, laboratoře MBÚ a ÚEM AV ČR a Immunotech .a.s. Tato spolupráce nám umožňuje rozšířit proteomové analýzy ze základních elektroforetických technik i na vícerozměrné chromatografické separace proteinů ( Proteome Lab PF 2D system, Beckman Coulter) a získat tak ucelenější pohled na studovaný biologický systém.

Adresa:
ÚŽFG AV ČR, v.v.i.
Laboratoř biochemie a molekulární biologie zárodečných buněk
Rumburská 89
277 21 Liběchov