Laboratoře

Laboratoř vývojové biologie

Vedoucí oddělení:

Kaňka Jiří , RNDr., DrSc.

Činnost oddělení:

Činnost laboratoře vývojové biologie je zaměřena na problematiku aktivace embryonálního genomu a exprese genů v průběhu časného embryonálního vývoje savců. Jako model jsou používána časná embrya myši a skotu a dále fibroblasty skotu, kultivované v podmínkách in vitro.
Vývoj savčího embrya v období před implantací je charakterizován třemi hlavními vývojovými přechody, ke kterým dochází po oplození oocytu – přechod od oocytární kontroly ke kontrole vývoje embryonálním genomem (zygotic gene activation – ZGA), kompaktace (jejímž výsledkem je polarizovaný epitel) a diferenciace moruly do blastocysty. ZGA představuje proces, který zahrnuje degradaci maternální mRNA v koordinaci s počátkem transkripce a následné translace mRNA syntetizované na základě embryonálního genomu. K aktivaci embryonálního genomu u myši dochází již na 2-buněčném stadiu, tedy velmi časně. Této hlavní aktivaci dokonce předchází transkripce začínající již na 1-buněčném stadiu. v samčím pranucleu. U embrya skotu je genom plně aktivován v pozdním 2-buněčném stadiu, existují však práce, popisující „minor activation“ již na 2-buněčném stadiu. Na rozdíl od myši, kde reprogramace genové exprese v průběhu časného embryonálního vývoje je dobře popsána, u embrya skotu stále zůstává celá řada nerozřešených otázek (Na řešení této problematiky byl zaměřen grant GA ČR reg. č. 204/02/1145 „Regulace transkripční aktivity v průběhu preimplantačního vývoje skotu“). Pracovnící naší laboratoře nalezli geny (molekulární márkry), které se exprimují v časném embryonálním vývoji skotu. V souvislosti s tím je sledována syntéza mRNA v průběhu embryonálního vývoje. Z hlediska vztahu exprese genů a vývojové schopnosti časných embryí skotu navrhujeme aplikovat metodu restriction fragment differential display RT PCR (RF DD-RT PCR) na problematiku časného embryonálního vývoje savců. Tato metodika používá fluorescenčně značených primerů, takže je možné eliminovat většinu práce s radioaktivitou. Touto metodou nalezené geny (exprimující se na počátku embryonálního vývoje) je možné použít k testování kvality vývoje embryí, která vznikla oplozením oocytů, izolovaných z různých kategorií definovaných folikulů. Tento postup umožňuje studovat vztah mezi expresí genů a vývojovými schopnostmi různých oocytů po oplození in vitro.
Laboratoř vývojové biologie se dále zabývá sledováním vlivu epidermálního růstového faktoru (EGF) na kumulární buňky prasete v různých stádiích folikulogeneze. Dosavadní výsledky ukazují, že EGF stimuluje proliferaci kumulárních buněk izolovaných z malých a středních folikulů, zatímco u kumulárních buněk izolovaných z preovulačních folikulů stimuluje remodelaci cytoskeletu a produkci hyaluronové kyseliny. Prokázali jsme, že tyto rozdíly jsou spojeny s různou úrovní fosforylace EGF receptoru.

Dále jsme se zabývali transkripcí genu pro růstový diferenciační faktoru 9 (GDF-9) v ovariální tkáni prasat. U hlodavců je GDF-9 exprimován specificky v oocytech v průběhu celé oogeneze. V preantrálních folikulech reguluje proliferaci granulozních buněk a v antrálních folikulech expresi různých proteinů, např. LH receptoru a enzymů, které řídí expanzi kumulárních buněk (produkci hyaluronové kyseliny) a ovulaci (např. produkcí prostaglandinů). Naše výsledky ukazují, že u prasete není gen pro GDF-9 exprimován výlučně v oocytech, jako je tomu u hlodavců, ale i v somatických buňkách folikulů. Předpokládáme, že tyto rozdíly jsou dány anatomickými poměry ve folikulech malých hlodavců a velkých hospodářských zvířat. U malých folikulů hlodavců může oocytem produkovaný GDF-9 kontrolovat celé prostředí ve folikulu. Toto však není možné u velkých preovulačních folikulů prasete a tak se na regulaci uvedených dějů podílejí i somatické buňky.
Předmětem našeho zájmu byla i kultivace časných embryí prasat s cílem zvládnou celý preimplantační vývoj , tj. ze stádia zygoty do stádia blastocysty, v prostředí in vitro. To je základním předpokladem pro zavedení moderních biotechnologických a biomedicínských metod do laboratorní praxe. Na základě literárních údajů a vlastních zkušeností jsme se rozhodli pro použití kultivačního média NCSU 23, které umožňuje vývoj embryí prasat přes kritické stádium čtyř buněk, kdy se aktivuje embryonální genom. Embrya byly získávána výplachem vejcovodů a kultivována v médium NCSU 23 po dobu 5-6 dnů. Embrya izolovaná v jednobuněčném stádiu se vyvíjela do blastocysty v 81 % a embrya izolovaná ve stádiu 3-4 buněk dosáhla stádia blastocysty v 87 % případů. Tyto výsledky potvrzují vhodnost námi zvolených podmínek pro kultivaci embryí prasete in vitro.