Seznam anotací:

1. Nové přístupy ve vývoji DNA senzorů. Hybridizace a elektrochemická detekce DNA a RNA na dvou různých površích (BFÚ)
2. Protinádorově účinné komplexy platiny ovlivňují vazbu nádorového supresorového proteinu p53 k DNA. Nová koncepce pro mechanismus účinku platinových cytostatik (BFÚ)
3. Sloupcová struktura telomerového chromatinu (BFÚ)
4. První trvale haploidní mnohobuněčný organismus (ENTÚ)
5. Genetická transformace bource morušového (ENTÚ)
6. Mechanismus přežívání hmyzu za nízkých teplot (ENTÚ)
7. Funkce muskarinových receptorů pro acetylcholin na molekulové úrovni (FGÚ)
8. Odhalení Cd36 jako genu, podmiňujícího inzulinovou rezistenci u hypertenzních potkanů v důsledku defektního metabolismu mastných kyselin a glukózy (FGÚ)
9. Degradace polutantů pomocí neenzymatických systémů (MBÚ)
10. Směrovaná polymerní léčiva (MBÚ)
11. Rezistence vůči antibiotikům a biosyntéza a biotransformace linkosamidů (MBÚ)
12. Metabolická degradace cytokininů v rostlinách a její fyziologický význam při řízení růstu a vývoje rostlin (ÚEB)
13. Úloha nukleotidy regulovaných bílkovin v řízení buněčné morfogeneze a stresové odpovědi rostlin (ÚEB)
14. Roskovitin - inhibitor cyklin-dependentních kináz na bázi rostlinných hormonů cytokininů (ÚEB)
15. Úloha gliových buněk v normální a patologicky změněné nervové tkáni (ÚEM)
16. Konkrescenční teorie vzniku savčích zubů je znovu aktuální (ÚEM)
17. Mechanismus genotoxicity chemických látek ve světle individuální vnímavosti (ÚEM)
18. Proměnlivost latentního viroidu chmele indukovaná v procesu tepelného opracování rostlin (ÚMBR)
19. Kadmium inhibuje epoxidaci diatoxantinu na diadinoxantin v xantofylovém cyklu mořské řasy phaeodactylum tricornutum (ÚMBR)
20. Mapování repetitivních genomových sekvencí u vicia spp. pomocí metody microarray (ÚMBR)
21. Úloha membránových mikrodomén v iniciaci časných signalizačních dějů na buněčném povrchu (ÚMG)
22. Identifikace genetických lokusů, které kontrolují hladinu imunoglobulinu E (ÚMG)
23. Antimetastatické účinky IL-2 a IL-12 u MHC I- nádorů indukovaných onkogeny EGIE7 HPV 16 (ÚMG)
24. Vztah vyšší architektury genomu obratlovců a variability podmínek prostředí (ÚŽFG)

5.1. Nové přístupy ve vývoji DNA senzorů. Hybridizace a elektrochemická detekce DNA a RNA na dvou různých površích
Emil Paleček

Dosud byl vývoj senzorů pro hybridizaci DNA založen na využití pevných elektrod, na kterých probíhala jak hybridizace DNA, tak detekční krok. V BFÚ byla navržena nová metoda: hybridizace DNA se provádí na komerčně dostupných magnetických kuličkách a elektrochemická detekce na detekčních elektrodách (DE). Díky minimální nespecifické adsorpci na magnetických kuličkách je dosaženo vysoké specificity hybridizace DNA (1,2). Výběr vhodné DE lze provést s ohledem na daný elektrodový proces. Ukázalo se, že vysoké citlivosti a specificity při detekci dlouhých cílových molekul DNA může být dosaženo (a) při použití katodické rozpouštěcí voltametrie na rtuťových nebo pevných amalgamových elektrodách pro stanovení purinových bází, uvolněných z DNA působením kyselin (1), nebo (b) při aplikaci enzymo-imunoanalýzy cílové DNA modifikované komplexem oxidu osmičelého s 2,2'-bipyridinem (Os,bipy) v kombinaci s elektrochemickou detekcí produktu enzymové analýzy na uhlíkové DE (2). Přímé měření DNA modifikované Os,bipy na uhlíkových a rtuťových elektrodách je rovněž možné (2-4).

1. E. Paleček, S. Billová, L. Havran, R. Kizek, A. Mičulková, F. Jelen: DNA hybridization at microbeads with cathodic stripping voltammetric detection. Talanta, in press (2002)
2. E. Paleček, R. Kizek, L. Havran, S. Billová, M. Fojta: Electrochemical enzyme-linked immunoassay in a DNA hybridization sensor. Anal. Chim. Acta, in press (2001)
3. R. Kizek, L. Havran, M. Fojta, E. Paleček: Determination of nanogram quantities of osmium-labeled single stranded DNA by differential pulse stripping voltammetry. Bioelectrochemistry, in press (2001)
4. M. Fojta, L. Havran, R. Kizek, S. Billová: Voltammetric microanalysis of DNA adducts with osmium tetroxide,2,2,'-bipyridine using a pyrolytic grafite electrode. Talanta, in press (2002)

5.2. Protinádorově účinné komplexy platiny ovlivňují vazbu nádorového supresorového proteinu p53 k DNA. Nová koncepce pro mechanismus účinku platinových cytostatik
Viktor Brabec

Gen p53 kóduje jaderný fosfoprotein, který je biologicky aktivován při genotoxickém ovlivňování buněk včetně působení protinádorově účinnými platinovými sloučeninami. V mechanismech potlačování růstu nádorů, ve kterých hraje roli protein p53, je klíčovým dějem vazba tohoto proteinu k DNA. Interakce fragmentů DNA a krátkých oligodeoxyribonukleotidových duplexů modifikovaných protinádorově účinnou cisplatinou (cis-diammindichloroplatnatým komplexem) a jeho klinicky neúčinným trans isomerem (transplatinou) s lidským proteinem p53 byly studovány pomocí změn v elektroforetické pohyblivosti DNA v gelu. Bylo zjištěno, že mechanismus protinádorové účinnosti cisplatiny souvisí s její účinností ovlivňovat vazebnou afinitu DNA modifikovanou protinádorově účinnými komplexy platiny k proteinu p53. Získané výsledky rozšiřují poznatkové zázemí o úloze nádorového supresorového proteinu p53 v mechanismu účinnosti cytostatik a poskytují také racionální základnu pro návrh nových platinových cytostatik a postupy pro jejich aplikaci.

1. Kašpárková, J., S. Pospíšilová, V. Brabec: Different recognition of DNA modified by antitumor cisplatin and its clinically ineffective trans isomer by tumor suppressor protein p53. J. Biol. Chem. 276: 16064-16069 (2001)

5.3. Sloupcová struktura telomerového chromatinu
Jiří Fajkus

Vlastní experimentální výsledky dosažené v letech 1995 - 2000 a výsledky dalších laboratoří zaměřených na strukturu chromatinu telomer byly shrnuty a použity k navržení modelu tzv. sloupcové struktury chromatinu telomer. V tomto modelu je DNA spojitě vinuta v paralelních závitech okolo histonových oktamerů navzájem spojených do sloupce. Od dosud známých modelů vyššího uspořádání nukleozómů ("solenoidálního" a "cik-cak") se nový model liší tím, že oblast spojovací DNA mezi nukleozómy je deformována (ohnuta) stejným způsobem jako nukleozomální DNA. Vzhledem k nízké energii interakce telomerové DNA s histonovým oktamerem je struktura stabilizována především "stacking" protein-proteinovými interakcemi mezi histonovými oktamery. Model vysvětluje dříve pozorované specifické vlastnosti telomerových nukleozómů (extrémně krátká a pravidelná periodicita telomerových nukleozómů při absenci sekvenčně determinované polohy nukleozómů, nestabilita krátkých fragmentů chromatinu projevující se klouzáním telomerové DNA po histonových oktamerech, zatímco delší chromatinová vlákna jsou stabilní) a je v souladu s absencí sekvenčně-determinovaných deformací na telomerové DNA. Tvorba sloupcové struktury je dle našeho modelu kooperativním procesem, takže určitá minimální délka chromatinového vlákna je nezbytná k dosažení termodynamické stability této struktury.

1. Fajkus, J., Trifonov, E. N.: Columnar packing of telomeric nucleosomes. Sekce "Breakthroughs and views". Biochem. Biophys. Res. Commun., 280: 961-963 (2001)
2. Fajkus, J., Trifonov, E. N.: Columnar structure of telomeric chromatin. 12^th Conversation in the Biomolecular Stereodynamics, Albany, N.Y., USA, 19. -23. 6. 2001. In: J. Biomol. Struct. Dyn., 18: 1017-1018 (2001)
3. Fajkus, J., Sýkorová, E., Trifonov, E.: Columnar structure of telomeric chromatin, 2nd European workshop on Role of Telomeres and telomerase in Cancer and Aging, Ladenburg, Germany 16. -18. 9. 2001

5.4. První trvale haploidní mnohobuněčný organismus

Naprostá většina vyšších organismů je diploidní, to znamená, že jejich buňky obsahují dvě sady chromosomů a tedy dvě sady molekul DNA. Pouze pohlavní buňky, gamety, jsou haploidní, a každá z nich při oplození přispívá novému organismu jednou sadou chromosomů. Toto zdvojení dědičné informace není samoúčelné, neboť poskytuje svému nositeli ochranu před projevem škodlivých změn (mutací), ať už zděděných od předků či nově vzniklých během života rodičů. Další velkou předností diploidie je kombinace rodičovských znaků zvyšující variabilitu v přírodních populacích. Z těchto důvodů bylo považováno za samozřejmé, že mezi mnohobuněčnými organismy (Metazoa) nebyl znám žádný případ trvalé či alespoň dlouhodobé existence samičích jedinců v haploidním stavu. Ve spolupráci se zahraničními kolegy (University of Amsterdam) jsme pomocí fluorescenční mikroskopie a molekulární genetiky prokázali, že obávaný škůdce řady ekonomicky významných kulturních plodin v tropech a subtropech amerického kontinentu, roztoč Brevipalpus phoenicisblue, je výjimkou z tohoto pravidla. Jeho populace jsou tvořeny výhradně haploidními, partenogeneticky (bez oplození) se množícími samicemi; samci jsou též haploidní, vyskytují se však jen sporadicky. Tato reprodukční anomálie je způsobena neznámou endosymbiotickou baktérií, jež dosud nezjištěným způsobem řídí vývoj pohlaví. U této skupiny roztočů je běžný haplo-diploidní způsob rozmnožování: z oplozených vajíček se vyvíjejí diploidní samice, z neoplozených haploidní samci. Haploidní roztoči druhu Brevipalpus phoenicis jsou tedy z genetického hlediska samci, ale přítomností baktérie dochází k jejich feminizaci.

Weeks, A. R., Marec, F., Breeuwer, J. A. J.: A mite species that consists entirely of haploid females. - Science 292: 2479-2482 (2001).
Některé ohlasy na tuto publikaci:
Uhlíř, M.: Bakterie mění pohlaví tropických roztočů. - Lidové noviny, 14.7.2001, str. 29.
Uhlíř, M.: Budou se rodit jen dívky? To nehrozí, říká český genetik, spoluautor unikátního výzkumu publikovaného v časopise Science. - Lidové noviny, 14.7.2001, str. 30. (Interview)
Otto, S., Jarne, P.: Haploids - Hapless of Happening? - Science 292: 2441-2443 (2001). (Komentář v sekci 'Perpectives')
Whitfield, J.: Single mite female. - Nature Science Update, 29.6.2001.
Frégaville O.: La mite mangueuse d'homme. - Quotidien (Paris), 29.6.2001.
Lasterade J.: Pas de parité chez les acariens d'Amazonie. - Libération, 30.6.2001.
Milben-Art kommt prima ohne Manner aus. - Rheinische Post, RP-online - Wissenschaft, 28.6.2001.

5.5. Genetická transformace bource morušového

Výzkum ekonomicky nebo lékařsky významných druhů hmyzu nemůže pokročit kupředu bez kauzálních důkazů funkce genů. Naše možnosti přinést takové důkazy jsou však omezené, neboť pro drtivou většinu hmyzu nebyla dosud genetická manipulace metodicky možná. Slibným přístupem, který by mohl zodpovědět základní biologické otázky u širokého spektra hmyzu, je zárodečná transformace. Jde o trvalé vnášení buď funkčních, nebo normální funkci narušujících genů do genomu hmyzu. Kontrolovaná přítomnost a aktivita těchto "transgenů" pak může odhalit normální roli genu v organismu. Rozvoj molekulárně biologických metod a zejména vybudování poměrně složitého instrumentálního zázemí umožnilo začlenit genetickou transformaci hmyzu mezi úkoly Entomologickém ústavu. Jako třetí tým ve světě (po Japonsku a Francii) jsme úspěšně transformovali zárodečnou linii bource morušového (Bombyx mori) transposonovým vektorem piggyBac. Do genomu bource jsme vnesli dva geny. První je GFP (zelený fluorescenční protein z medusy Aequorea victoria). Aktivita GFP, řízená faktorem pro vývoj fotoreceptorů Pax6, je viditelná v oku motýla. Zatímco GFP slouží pouze jako marker, druhý gen kóduje jaderný receptor Ftz-F1, důležitý pro vývoj hmyzu. Aktivitu genu Ftz-F1 jsme indukovali tepelným šokem přímo v živých larvách bource tak, že jsme Ftz-F1 umístili za teplotně citlivou regulační oblast genu hsp70 z octomilky Drosophila melanogaster. Poprvé jsme tak ukázali možnost řídit aktivitu uměle vloženého genu v živém hmyzu (kromě octomilky). Tento výzkum je nezbytnou předběžnou podmínkou pro další genové manipulace u hmyzu. Časově řízená exprese vložených genů nám umožní studovat genetickou koordinaci vývoje cílového organismu.

Uhlířová M., Asahina M., Riddiford L.M. and Jindra M. (2002) Heat inducible gene expression in transgenic Bombyx mori. Dev. Genes Evol. (in press).

5.6. Mechanismus přežívání hmyzu za nízkých teplot

Zkracující se den pozdního léta vyvolává u hmyzu hormonálně řízené přerušení vývoje, jehož poznání je klíčem k lepší prognóze kalamitního výskytu škůdců. Pro přezimování dospělých jedinců je důležité snížení produkce juvenilního hormonu ze žláz zvaných corpora allata (CA). U modelového druhu Pyrrhocoris apterus jsme zčásti objasnili regulaci CA mozkem. U nediapauzních ploštic reaguje mozek na příjem potravy a hladovění produkcí "pomalého" stimulátoru a "rychlého" inhibitoru, jejichž rovnováha určuje aktivitu CA. Inaktivace působením "rychlého" inhibitoru je snadno odstraněna několikahodinovou inkubací CA v přítomnosti stimulátoru. Zkrácení dne vyvolává produkci "pomalého" inhibitoru, který navozuje diapauzu. Její intenzita je krom fotoperiody závislá na diurnálních změnách teploty, např. při střídání teploty 25°C (den) a 15°C (noc) je diapauza hlubší než při srovnatelné stálé teplotě 20°C. Přezimování při teplotách pod nulou (až -15°C) je umožněno nahromaděním cukerných látek typu polyolů (ribitol, sorbitol, mannitol, arabinitol, myo-inositol), které probíhá pouze pod teplotním prahem 5°C a není možné u nediapauzních ploštic. Množství akumulovaných polyolů těsně koreluje se schopností přežívat extrémně nízké teploty a po injikaci směsi polyolů do hemolymfy se chladová odolnost uměle zvýší. Jelikož však celková koncentrace nahromaděných polyolů nepřesahuje 100 mM, neovlivní podstatně teplotu krystalizace tělních tekutin v led ani jiné vlastnosti závisející na počtu molekul. Domníváme se proto, že akumulované kryoprotektanty zvyšují chladovou odolnost především tím, že se podílejí na udržování prostorového uspořádání funkčních skupin proteinů a biologických membrán za nízkých teplot.

Hodková, M., Okuda, T., Wagner, R.: Regulation of corpora allata in females of Pyrrhocoris apterus (Heteroptera) (A mini-review). In Vitro Cell Dev. Biol. 37: 560-563 (2001).
Kalushkov, P., Hodková, M., Nedvěd, O., Hodek, I.: Effect of thermoperiod on diapause intensity in Pyrrhocoris apterus (Heteroptera: Pyrrhocoridae). J. Insect Physiol. 47: 55-61 (2001).
Košťál, V., Šlachta, M.: Cold acclimation during overwintering of Pyrrhocoris apterus (Insecta: Heteroptera). Acta Soc. Zool. Bohem., in press.
Košťál, V., Šlachta, M., Šimek, P.: Cryoprotective role of polyols independent of the increase in supercooling capacity in diapausing adults of Pyrrhocoris apterus (Heteroptera: Insecta). Comp. Biochem. Physiol. B 130, 365-374 (2001).
Šlachta, M., Berková, P., Vambera, J., Košťál, V.: Physiology of cold acclimation in the non-diapausing adults of Pyrrhocoris apterus (Heteroptera). Eur. J. Entomol., in press.

5.7. Funkce muskarinových receptorů pro acetylcholin na molekulové úrovni

Muskarinové receptory pro acetylcholin zprostředkují přenos povelů, kterými nervová vlákna aktivují žlázy v zažívacím traktu, stimulují kontrakce hladkých svalů, zpomalují a oslabují kontrakce srdečního svalu anebo se podílejí na regulaci uvolňování různých mediátorů. V minulých letech jsme objevili pozitivní alosterické interakce mezi některými látkami, které prostřednictvím muskarinových receptorů působí. Tyto interakce se projevovaly tím, že se v pokusech na buněčných membránách v přítomnosti určitých látek (alosterických modulátorů) zvyšovala citlivost muskarinových receptorů vůči jiným látkám, jimiž se receptory aktivují nebo blokují. Další práce vedla k podstatnému prohloubení poznatků o pozitivních alosterických interakcích na muskarinových receptorech. Podařilo se prokázat, že mají funkční důsledky, tj. mohou zvýšit účinek muskarinového receptoru při regulaci určité funkce (citace 1). Provedením cílených mutací nebo výměnou celých úseků DNA, která kóduje syntézu nových receptorů, se podařilo vyjasnit, že v mechanismu zatím známých pozitivních alosterických interakcí hraje rozhodující úlohu třetí extracelulární klička na zevním povrchu molekuly receptoru (citace 2). Podařilo se také nalézt rysy, které jsou společné pro molekuly modulátorů s pozitivním alosterickým působením (citace 3). Tyto poznatky jsou důležité pro vysvětlení, jak se vlivem modulátoru mění konformace molekuly receptoru a jaké vlastnosti musí mít molekula modulátoru, aby měla optimální účinek. Alosterická modulace funkce receptorů představuje důležitou možnost, jak zasahovat do řízení buněčných funkcí.

Citace:

1. Doležal, V., Tuček, S.: The efects of brucine and alcuronium on the inhibition of [³H]acetylcholine release from rat striatum by muscarinic receptor agonists. - Brit. J. Pharmacol. 124: 1213-1218 (1998).
2. Krejčí, A., Tuček, S.: Changes of cooperativity between N-methylscopolamine and allosteric modulators alcuronium and gallamine induced by mutations of external loops of muscarinic M₃  receptors. - Mol. Pharmacol. 60: 761-767 (2001).
3. Lysíková, M., Havlas, Z., Tuček S.: Interactions between allosteric modulators and 4-DAMP and other antagonists at muscarinic receptors: potential significance of the distance between the N and carboxyl C atoms in the molecules of antagonists. - Neurochem. Res. 26: 383-394 (2001).

5.8. Odhalení Cd36 jako genu, podmiňujícího inzulinovou rezistenci u hypertenzních potkanů v důsledku defektního metabolismu mastných kyselin a glukózy

Esenciální hypertenze představuje geneticky komplexní metabolickou a kardiovaskulární poruchu regulace krevního tlaku. Spontánně hypertenzní potkani kmene SHR patří mezi nejčastěji používané modely esenciální hypertenze. Tento kmen potkanů má vysoký krevní tlak a řadu abnormalit metabolismu tuků a uhlovodíků. Analýza exprese více než 10 000 genů pomocí cDNA biočipů odhalila u kmene SHR mutaci genu Cd36, kódujícího přenašeč dlouhých mastných kyselin přes buněčné membrány. Definitivní důkaz pro identitu mutovaného Cd36 genu s genetickým faktorem, odpovědným za koincidenci několika kardiovaskulárních rizikových faktorů, však bylo možné získat jen pomocí funkční analýzy, produkcí Cd36 transgenních SHR potkanů. Při komplementační analýze byl do embryí kmene SHR injikován genový konstrukt normálního Cd36 genu, izolovaného z kmene Wistar Kyoto. Exprese normálního Cd36 genu vedla u transgenních zvířat ke zlepšení glukózové intolerance, ke snížení plazmatických hladin neesterifikovaných mastných kyselin, ke zvýšení účinku inzulinu na svalovou tkáň (měřeno v bráničním svalu jako inkorporace radioaktivně značené glukózy do glykogenu) a u jedné transgenní linie došlo i ke snížení krevního tlaku. Exprese Cd36 transgenu u kmene SHR prakticky komplementovala několik metabolických poruch a hypertenzi, které jsou asociované s delecí Cd36 genu. Tím byl získán rozhodující důkaz pro důležitou roli Cd36 v determinaci několika rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění.

Citace:
Pravenec, M., Landa, V., Zídek, V., Musilová, A., Křen, V., Kazdová, L., Aitman, T.J., Glazier, A.M., Qi, N., Wang, J., St. Lezin, E.M., Kurtz, T.W.: Transgenic rescue of Cd36 improves insulin resistance and dyslipidemia in spontaneously hypertensive rats. - Nature Genetics 27: 156-158 (2001).

5.9. Degradace polutantů pomocí neenzymatických systémů.
František Nerud, Petr Baldrian, Jiří Gabriel

Rozsáhlé znečištění povrchových vod, půdy a sedimentů toxickými látkami, které jsou důsledkem rozvoje průmyslu, vyvolává potřebu vývoje nových metod pro ozdravění životního prostředí. Jedním z moderních směrů v remediaci znečištěných půd či vod je uplatnění tzv. Advanced Oxidation Technologies pomocí radikálových mechanismů. Pracovníci Sektoru ekologie MBÚ AV ČR vyvinuli několik systémů kov-ligand-hydroperoxid, které byly použity pro dekolorizaci průmyslových barviv různého chemického složení (azo, trifenylmethanová, antrachinonová, heterocyklická, thiazinová a akridinová barviva). Systémy byly úspěšně testovány kromě dekolorizace reálných odpadů z textilního průmyslu i pro degradaci polycklických aromatických uhlovodíků a metyl terc-butyl eteru (MTBE).

Dekolorizace barviv i degradace dalších polutantů probíhá velmi rychle (během 5-24 h) Učinnost systémů (75-99%) závisí na koncetraci oragnopolutantu a použitém ligandu. Pomocí EPR spektroskopie byl navržen pravděpodobný mechanismus reakce, který souvisí s produkcí hydroxylových radikálů.

Systémy, které jsou nyní předmětem intezivního studia, mohou být vhodným doplňkem nebo předstupněm stávajících remediačních postupů.

Nerud F., Baldrian P., Gabriel J., Ogbeifun D.: Decolorization of synthetic dyes by the Fenton reagent and Cu/pyridine/hydrogen peroxide system. Chemosphere 44, 957-961 (2001).

Gabriel J., Shah V., Nesměrák K., Baldrian P., Nerud F.: Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by the copper(II)-hydrogen peroxide system. Folia Microbiol. 45, 573-575 (2000).

5.10. Směrovaná polymerní léčiva
Blanka Říhová, Markéta Jelínková, Ondřej Hovorka, Marek Kovář, Milada Šírová, Marek Šťastný, Tomáš Mrkvan, Jindřiška Pokorná, Dan Renčiuk

Klasická chemoterapie je toxická a nespecifická. Kromě maligních buněk postihuje i zdravé, rychle se dělící buňky. Proto je takovou léčbou nejvíce ohrožena kostní dřeň, gonády a zažívací trakt, ale v závislosti na použitém cytostatiku také ostatní zdravé orgány. Nepříjemné vedlejší účinky chemoterapie jsou ostatně všeobecně dobře známy.

5.11. Rezistence vůči antibiotikům a biosyntéza a biotransformace linkosamidů
Jiří Janata, Jan Kopecký, Lucie Najmanová, Gabriela Novotná, Stanislav Pospíšil,Jaroslav Spížek

Methicilin-rezistentní kmeny Staphylococcus aureus jsou příčinou velmi vážných infekcí, zejména nemocničních. Hlavním problémem těchto infekcí je jejich obtížná léčba související s vícečetnou rezistencí těchto kmenů vůči řadě antibiotik. Kromě rezistence k ?-laktamovým antibiotikům první volby jsou téměř všechny kmeny rezistentní také vůči gentamicinu a mnohé z nich i vůči dalším antibiotikům (erythromycinu, klindamycinu, kotrimoxazolu, ciprofloxacinu, tetracyklinu a v menší míře i k amikacinu, chloramfenikolu, muciprocinu a kyselině fusidové). Častou alternativou penicilinů a cefalosporinů jsou makrolidová a linkosamidová antibiotika, případně streptograminy. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy mají přes svou odlišnou chemickou strukturu stejné zásahové místo na ribozómech a patří do jedné rezistenční skupiny MLS. Nejčastějšími determinantami MLS rezistence jsou geny ermC a ermA, které kódují methyltransferázy modifikující společné zásahové místo makrolidů i linkosamidů. Méně častými determinantami jsou gen msrA, který je zodpovědný za vypuzování makrolidů nikoli však linkosamidů z bakteriální buňky, a gen linA, jehož proteinový produkt inaktivuje pouze linkosamidová antibiotika. Pomocí molekulárně biologických metod bylo zjištěno, že v České republice je gen msrA mnohem četnější než v jiných zemích a že je v našich nemocnicích dokonce dominantní a že překvapivě častý je i gen linA. Tato zjištění jsou důležitá z hlediska cílené léčby antibiotiky.
Při studiu biosyntézy linkomycinu u Streptomyces lincolnensis bylo zjištěno, že za závěrečný krok biosyntézy, tj. přeměnu demethyllinkomycinu na linkomycin, je zodpovědný gen lmbJ kódující specifickou N-demethyllinkomycin methyltransferasu. V těsném sousedství genu lmbJ byl nalezen nový gen lmbIH, jehož exprese je koregulována s expresí genu lmbJ, který má při biosyntéze linkomycinu zřejmě regulační úlohu. Na základě získaných výsledků jsou připravovány kmeny s novými biosyntetickými aktivitami s cílem získat nové antibioticky aktivní látky, které by byly účinné proti rezistentním kmenům Staphylococcus aureus.
Pomocí biotransformace a chemické transformace linkomycinu byly získány nové deriváty které mají kromě antibiotické aktivity i významnou aktivitu radioprotektivní.

Janata J., Najmanová L., Novotná J., Holá K., Felsberg J., Spížek J.: Putative lmbI and lmbH genes form a single lmbIH ORF in Streptomyces lincolnensis type strain ATCC 25466. Antonie van Leeuwenhoek 78, 277-284 (2001).
Pospíšil S., Sedmera P., Halada P., Spížek J.: Oxidation of lincomycin by hydrogen peroxide restricts its potential biotrasnformation with haloperoxidases. Folia Microbiol. 46, 376-378 (2001).

5.12. Metabolická degradace cytokininů v rostlinách a její fyziologický význam při řízení růstu a vývoje rostlin
Václav Motyka, Miroslav Kamínek a kol.
Cytokininy jsou přirozené rostlinné hormony, které se podílejí na regulaci dělení a diferenciace buněk, a tak výrazně zasahují do řízení růstu a vývoje rostlin. Nedávné sekvenování genomu huseníčku (Arabidopsis thaliana L.) umožnilo dosáhnout průlomových poznatků v oblasti metabolismu cytokininů včetně jejich odbourávání katalyzovaného enzymem cytokininoxidázou. Úloha cytokininoxidázy při regulaci hladin cytokininů byla studována s ohledem na její fyziologický význam pro navození a zachování hormonální rovnováhy v rostlinných buňkách. Ke studiu bylo použito buněčných kultur a intaktních rostlin tabáku, u nichž je obsah cytokininů experimentálně změněn jejich aplikací nebo vnesením bakteriálního genu ipt kódujícího biosyntézu cytokininů či ckx genu(ů) z huseníčku kódujícího(cích) odbourávání cytokininů. Navozené změny vnitřních hladin cytokininů vedou k výrazným změnám aktivity cytokininoxidázy, zastoupení jejích různých molekulárních forem s odlišnými biochemickými vlastnostmi a odlišnou vnitrobuněčnou lokalizací a exkrecí vně buňky. Na úrovni intaktních rostlin byly pozorovány podstatné vývojové změny, např. odlišný růst a větvení stonků a kořenů, změny v olistění aj. Získané poznatky, jejichž platnost byla ověřena v pokusech s pletivy pšenice a petunie a s genetickými mutanty huseníčku, ukazují na významnou fyziologickou úlohu cytokininoxidázy v regulaci hladin cytokininů, jakož i při řízení rostlinné morfogeneze. Naznačují možnost využití indukovaných změn hladin cytokininů k ovlivnění produktivity hospodářsky významných plodin.

Motyka, V., Faiss, M., Strnad, M., Kamínek, M., Schmülling,T.: Changes in cytokinin content and cytokinin oxidase activity in response to derepression of ipt gene transcription in transgenic tobacco calli and plants. - Plant Physiol. 112: 1035-1043 (1996).
Kamínek, M., Motyka, V., Vaňková, R.: Regulation of cytokinin content in plant cells. - Physiol. Plant. 101: 689-700 (1997).
Redig, P., Motyka, V., Van Onckelen, H.A., Kamínek, M.: Regulation of cytokinin oxidase activity in tobacco callus expressing the T-DNA ipt gene. - Physiol. Plant. 99: 89-96 (1997).
Auer, C., Motyka, V., Březinová, A., Kamínek, M.: Endogenous cytokinin accumulation and cytokinin oxidase activity during shoot organogenesis of Petunia hybrida. - Physiol. Plant. 105: 141-147 (1999).
Benková, E., Witters, E., Van Dongen, W., Kolář, J., Motyka, V., Brzobohatý, B., Van Onckelen, H., Macháčková, I.: Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurence and changes due to light/dark treatment. - Plant Physiol. 121: 245-251 (1999).
Zažímalová, E., Kamínek, M., Březinová, A., Motyka, V.: Control of cytokinin biosynthesis and metabolism. - In: Hookyaas,P.P.J., Hall,M.A., Libbenga,K.R. (eds.), Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones. Pp.141-160, Elsevier Science B.V. 1999.
Frank, M., Rupp, H.-M., Prinsen, E., Motyka, V., Van Onckelen, H., Schmülling, T.: Hormone autotrophic growth and differentiation identifies mutant lines of Arabidopsis with altered cytokinin and auxin content or signaling. - Plant Physiol. 122: 721-730 (2000).
Werner, T., Motyka, V., Strnad, M., Schmülling, T.: Regulation of plant growth by cytokinin. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10487-10492 (2001).
Dobrev, P., Motyka, V., Gaudinová, A., Malbeck, J., Trávníčková, A., Kamínek, M., Vaňková, R.: Transient accumulation of cis- and trans-zeatin type cytokinins and its relation to cytokinin oxidase activity during cell cycle of synchronized tobacco BY-2 cells. - Plant Physiol Biochem (v tisku).
Motyka, V., Vaňková, R Čapková, V., Petrášek, J., Kamínek, M., Schmülling,T.: Cytokinin-induced upregulation of the cytokinin oxidase activity in tobacco includes changes in enzyme glycosylation and excretion indicating an extracellular degradation pathway for cytokinins. - (odesláno do tisku).

5.13. Úloha nukleotidy regulovaných bílkovin v řízení buněčné morfogeneze a stresové odpovědi rostlin
Viktor Žárský a kol.

Pro schopnost rostlin odolat nepříznivému výkyvu životního prostředí (především teplotnímu stresu) je typická indukce syntézy zvláštních ochranných bílkovin - tzv. malých bílkovin teplotního šoku. Objevili jsme (Smýkal et. al. 2000) nový princip jejich regulace pomocí hladiny ATP (adenosintrisfosfátu) v buňkách. Ukázali jsme, že ve fázi akutního stresu, kdy se hladina ATP v buňkách snižuje, se zároveň zvyšuje afinita těchto ochranných bílkovin ke složkám buněk ohrožených stresem. Při opadnutí akutní fáze stresu jsou zvýšenou hladinou ATP tyto buněčné složky z komplexu uvolňovány. Podobný nukleotid jako ATP, guanosintrisfosfát (GTP) hraje významnou úlohu ve tvarování buněk a orgánů rostlin, na kterém se podílí řada regulačních faktorů. Naše práce (Žárský et al. 1997, shrnuto v Cvrčková et al. 2001) přispěla k odhalení regulační úlohy rostlinných bílkovin vázajících GTP (tzv. malé GTPázy) v řízení buněčné polarity a morfogeneze. Mikroinjekce analogů GTP/GDP, které nemohou být metabolizovány, do živých polarizovaných rostlinných buněk, vede ke ztrátě jejich polarity (Eliáš et al. 2001).

Moore, I., Diefenthal, T., Žárský, V., Schell, J., Palme K.: A homolog of the mammalian GTPase Rab2 is present in Arabidopsis and is expressed predominantly in pollen grains and seedlings. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:762-767 (1997).
Palme, K., Bischoff, F., Cvrčková, F., Žárský V.: Small G-proteins in Arabidopsis thaliana. Biochem. Soc. Transactions 25:1001-1005 (1997).
Žárský, V., Cvrčková, F., Bischoff, F., Palme, K.: At-GDI1 from Arabidopsis thaliana encodes a rab-specific GDI that complements the sec19 mutation of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters 403:303-308, (1997a).
Žárský, V., Cvrčková, F.: Small GTPases in the morphogenesis of yeast and plant cells. In: Molecular mechanisms of signalling and membrane transport, edited by K. W. A. Wirtz, Berlin, Heidelberg, New York:Springer-Verlag, p. 75-88 (1997b).
Žárský, V., Cvrčková, F.: Rab and Rho GTPases in yeast and plant cell growth and morphogenesis. In: Advances in regulation of plant growth and development, edited by M. Strnad, P. Peč and B. Beck, Praha, Peres, p. 49-58 (1999).
Smýkal, P., Mašín, J., Hrdý I., Konopásek, I., Žárský V.: Chaperone activity of tobacco HSP18, a small heat-shock protein, is inhibited by ATP. Plant J. 23(6):703-13 (2000).
Cvrčková, F., Eliáš, M., Hála, M., Obermeyer, G., Žárský V.: Small GTPases and conserved signalling pathways in plant cell morphogenesis: from exocytosis to the Exocyst. In:Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth, eds.: A. Geitmann, M.Cresti and I.B.Heath, Amsterdam: IOS Press, pp.105-122 (2001).
Eliáš, M., Cvrčková, F., Obermeyer, G., Žárský V.: The effects of guanine nucleotide analogues on tip growth of lily pollen tubes. Plant Biology 3: 489 - 492 (2001).

5.14. Roskovitin - inhibitor cyklin-dependentních kináz na bázi rostlinných hormonů cytokininů
Miroslav Strnad a kol.

Náš výzkum soustřeďující se na poznání molekulárních mechanismů účinku cytokininů v regulaci buněčného dělení prokázal, že přirozené rostlinné hormony cytokininy jsou obecně nespecifickými inhibitory živočišných cyklin-dependentních kináz (CDK), klíčových enzymů každé eukaryotické buňky, ve které regulují aktivitu řady proteinů buněčného cyklu. Za velmi závažnou lze považovat skutečnost, že v řadě lidských nádorů jsou cykliny a cyklin-dependentní kinázy abnormálně regulovány. Pro první specifický inhibitor kinázy označované cdc2 odvozený od N⁶-benzylaminopurinu (BAP) byl navržen název olomoucin (OC) (Veselý et al. 1994). OC zastaví buněčný cyklus v určité fázi a tím zastaví i buněčné dělení. Inhibiční aktivita OC byla dále zvýšena chemickými modifikacemi molekuly a tento přístup vedl k vývoji nového, vysoce účinného inhibitoru CDK roskovitinu (ROSC, 6-(benzylamino)-2(R)/1-hydroxymethylpropyl/ami-no-9-isopropylpurin (Havlíček et al. 1997, de Azevedo et al. 1997). Ten vykazuje zvýšenou inhibiční aktivitu pro kinázu CDK1 i pro buněčné dělení a také mnohem silnější protinádorové účinky (Binarová et al. 1998, Hajdúch et al. 1999). Nedávno jsme zjistili, že tyto látky dokáží navodit u nádorových buněk mechanismus vedoucí následně k jejich smrti (Kotala et al. 2001). Tyto účinky jsou vysoce specifické pouze pro nádorové buňky. Z těchto důvodů má nová generace protinádorových látek na bázi olomoucinu minimální vedlejší účinky, jak bylo posléze prokázáno při předklinickém zkoušení roskovitinu. Tento derivát prošel v loňském roce úspěšně první fází klinického zkoušení a v současné době je povolen v Německu, Francii a Velké Británii ke klinickému zkoušení druhé fáze.

Veselý, J., Havlíček, L., Strnad, M., Blow, J.J., Donella-Deana, A., Pinna, L., Letham, D.S., Kato, J., Detivaud, L., Leclerc, S., Meijer, L.: Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogues. - Eur. J. Biochem. 224: 771-786 (1994).
De Azevedo, W. F., Leclerc, S., Meijer, L., Havlíček, L., Strnad, M., Kim, S.- H. Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analoques. Crystal structure of human cdk2 complexed with roscovitine. - Eur. J. Biochem. 243: 518-526 (1997).
Havlíček, L., Hanuš, J., Veselý, J., Leclerc, S., Meijer, L., Shaw, G., Strnad, M.: Cytokinin-derived cyclin dependent kinase inhibitors. Synthesis and cdc2 inhibitory activity of olomoucine and related compounds. - J. Med. Chem. 40: 408-412 (1997).
Meijer, L., Bisagni, E., Legraverend, M., Strnad, M.: Novel purine derivatives having, in particular, antiproliferative properties, and biological uses thereof. - WO 97/20842, 53 pp. (1997).
Binarová, P., Bögre, L., Doležel, J., Hirt, H, Heberle-Bors, E., Strnad, M.: Treatment of Vicia faba root tip cells with specific inhibitors to cyclin-dependent kinases leads to abnormal spindle formation. - Plant J. 16: 697-707 (1998).
Havlíček,L., Hajdúch, M., Strnad, M.: Cyclin-dependent kinase inhibitor. Patent Applied in Australia, Canada, Japan, Korea and USA, (1998).
Hajdúch, M., Nosková, V., Feketová, G., Novotný, R., Jess, K., Gojová, L., Kašpárek, I., Kryštof, V., Veselý, J., Strnad, M., Mihál, V.: Olomoucine derived synthetic cyclin dependent kinase inhibitors. p.341-353. In: Pieters, R., Veerman, A., Kaspers, G.J.L (eds.), New generation of potent anti-cancer drugs. Drug Resistance in Leukaemia and Lymphoma, Advances in Experimental Medicine and Biology, Plenum Press, New York, (1999).
Otyepka,M., Kryštof,V., Havlíček, L., Siglerová, V., Strnad, M., Koča, J.: Docking-based development of purine-like inhibitors of Cdk2. - J. Med. Chem. 43: 2506-2513 (2000).
Kotala, V., Uldrijan, S., Horký, M., Trbusek, M., Strnad, M., Vojtěšek, B.: Potent induction of wild-type p53-dependent transcription in tumour cells by a synthetic inhibitor of cyclin-dependent kinases. CMLS 58: 1333-1339 (2001).

5.15. Úloha gliových buněk v normální a patologicky změněné nervové tkáni

Prokázali jsme změněné elektrofyziologické a morfologické vlastností gliových buněk v míše, které mohou nastat během patologických stavů v CNS. Zjistili jsme, že membránové vlastnosti jednotlivých typů gliových buněk, t.j. astrocytů, oligodendrocytů a prekurzorových buněk, jsou shodné v míše potkana, myši a žáby. Ukázali jsme, že změny množství a morfologie gliových buněk ovlivňují difúzi neuroaktivních látek v extracelulárním prostoru. Analýza změn difúzních parametrů extracelulárního prostoru během ischémie CNS ukázala, že jsou tyto změny vyvolány především zvětšováním objemu gliových buněk a jejich výběžků. Studium hromadění K⁺ po depolarizaci membrány gliových buněk v míše potkana za různých osmotických podmínek prokázalo, že v těsné blízkosti oligodendrocytů je "difúzní bariéra", která brání difúzi K⁺ nahromaděného v průběhu depolarizačního pulzu a po ukončení depolarizačního pulzu způsobuje zvýšený přesun K⁺ přes membránu zpět do buňky. Přítomnost takových difúzních bariér v okolí oligodendrocytů může výrazně ovlivnit nejen směr difúze iontů a neuroaktivních látek v extracelulárním prostoru nervové tkáně ale i přenos signálů v CNS. Při patologických dějích v CNS se zmnožuje gliální fibrilární kyselý protein (GFAP), jehož funkce není zcela objasněna. U geneticky modifikovaných myší bez přítomnosti tohoto proteinu jsme prokázali, že GFAP-negativní astrocyty mají tenčí výběžky a méně a pomaleji mění svůj objem po aplikaci 50 mM K⁺ nebo hypotonického roztoku. Dále jsme prokázali, že zvýšená koncentrace glutamátu, která se vyskytuje během poranění mozku a míchy a celé řady dalších patologických stavů, vyvolává změny v objemu extracelulárního prostoru, astrogliózu a s ní související změny difúzních bariér. Tyto změny mohou ovlivňovat nejen extrasynaptický přenos, ale i neurotoxicitu glutamátu a následně poškození nervových buněk.
Chvátal, A., Anděrová, M., Žiak, D., Orkand, R.K., Syková, E.: Membrane currents and morphological properties of neurons and glial cells in the spinal cord and filum terminale of the frog. Neurosci. Res. 40: 23-35 (2001).
Vargová, L., Chvátal, A., Anděrová, M., Kubinová, Š., Žiak, D., Syková, E.: Effect of osmotic stress on potassium accumulation around glial cells and extracellular space volume in rat spinal cord slices. J. Neurosci. Res. 65: 129?138 (2001).
Anděrová, M., Kubinová, Š., Mazel, T., Chvátal, A., Eliasson, C., Pekny, M., Syková, E.: Effect of elevated K+, hypotonic stress and cortical spreading depression on astrocyte swelling in GFAP-deficient mouse. Glia 35:189-203 (2001).
Vargová, L., Jendelová, P., Chvátal, A., Syková, E.: Glutamate, NMDA and AMPA induced changes in extracellular space volume and tortuosity in the rat spinal cord. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21: 1077-1089 (2001).
Syková, E.: Glial diffusion barriers during aging and pathological states. Prog. Brain Res. 132: 339-363 (2001).

5.16. Konkrescenční teorie vzniku savčích zubů je znovu aktuální

Naše nálezy přispívají k více než sto let trvající diskusi o způsobu vzniku mnoho-hrbolkových zubů u savců a svědčí o tom, že splývání zubních základů (konkrescence) by se mohlo uplatňovat během diferenciace savčích zubů v průběhu ontogenetického a fylogenetického vývoje. Formulovali jsme hypotézu o vzniku dentice u myši pučením a splýváním epitelových pupenů, regulovaným výslednou interakcí mezi růst aktivujícími a inhibujícími morfogeny. Známky splývání epitelových pupenů, které jsme při vývoji funkčních zubů u myši nalezli, lze vysvětlit zánikem mezer oddělujících jednotlivé pupeny v důsledku oslabení funkce inhibitorů. Tyto vlastnosti embryonální dentice u myši umožnily porovnání jejího vývoje jednak s tradičními modely používanými ke studiu epitelového pučení (vznik peří, plic), a jednak s vývojem mnoho-generační dentice u plazů. Navíc jsme zásadním způsobem změnili dosavadní představu o vývoji myší dentice. U embryí se vyvíjejí rudimentární zubní základy i v budoucích bezzubých mezerách horní i dolní čelisti. Přestože tyto rudimenty posléze zanikají, jejich přítomnost na časných stádiích u myši naznačuje uchování základního vzorce mnohem početnější a periodicky uspořádané dentice zděděné po předcích. Poznání regulace normálního vývoje zubů na experimentálním modelu pomáhá odhalit příčiny zubních vad u člověka.

Peterková R., Peterka M., Viriot, L., Lesot, H.: Dentition development and budding morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 20: 158-172 ( 2000).
Peterková R., Peterka M., Viriot L., Lesot H.: Development of the vestigial tooth primordia as part of mouse odontogenesis. Connect. Tissue Res. (v tisku).

5.17. Mechanismus genotoxicity chemických látek ve světle individuální vnímavosti.

Při sledování mechanismů poškození genetické informace cizorodými, potenciálně karcinogenními látkami, jejichž reprezentanty byly styren a 1,3-butadien, jsme v roce 2001 dosáhli významného pokroku. U obou zmíněných látek byla jako významný specifický indikátor poškození DNA stanovena hladina N1-adeninových adduktů v DNA, a to i u lidské populace. DNA addukty na N1-pozici adeninu jsme schopni stanovovat kvantitativně i kvalitativně, a tím obdržíme jednak přímý parametr biologického účinku potenciálně karcinogenní látky, jednak individuální parametr metabolické a reparační kapacity. Při studiu mechanismů poškození DNA (genotoxických účinků) styrenem a 1,3-butadienem jsme se zaměřili rovněž na úlohu rozdílné genetické výbavy v metabolizujících enzymech při kumulaci genetického poškození (vliv individuální vnímavosti). U osob exponovaných styrenu jsme nalezli vliv heterozygozity cytochromu P450 na hladiny jednořetězcových zlomů v DNA a na frekvence mutací v HPRT genu. Osoby s genotypem nízké a střední aktivity epoxid hydrolázy vykazovaly vyšší hladiny chromosomálních aberací. U osob exponovaných 1,3-butadienu byly vyšší hladiny N1-adeninových adduktů DNA detekovány u jedinců s chybějící alelou pro glutathion S-transferázu M1. Vzestup N1-adeninových adduktů DNA významně souvisí s hladinou expozice a genotypem glutathion S-transferázy M1. Tento typ studií může být velmi užitečný v předvídání individuálního rizika.

P. Vodička, P. Souček, A.D. Tates, M. Dušinská, J. Šarmanová, M. Zámečníková, L. Vodičková, M. Koskinen, F.A. de Zwart, A.T. Ntarajan, K. Hemminki.: Association between genetic polymorphismss and biomarkers in styrene-exoposed workers. Mutat. Res. 482: 89-103 (2001).
Ch. Zhao, P. Vodička, R.J. Šrám, K. Hemminki.: DNA adducts of 1,3-butadiene in humans: Relationship to exposure, GST genotypes, single-strand breaks and cytogenetic end points. Environ. Mol. Mutagen. 37: 226-230 ( 2000).,
M. Koskinen, P. Vodička, K. Hemminki.: Identification of 1-adenine DNA adducts in workers occupationally exposed to styrene. J. Occup. Environ. Med. 43: 694-700 ( 2000).

5.18. Proměnlivost latentního viroidu chmele indukovaná v procesu tepelného opracování rostlin

MATOUŠEK, J.,PATZAK,J., ORCTOVÁ, L. , SCHUBERT, J., VRBA, L., STEGER, G., RIESNER, D.
Práce popisuje nový jev zvýšeného hromadění změn v dědičném aparátu jednoho z důležitých parazitů chmelu-latentního chmelového viroidu. Při zvýšené teplotě kultivace rostlin, tj. za stresových teplotních podmínek, se tyto změny hromadí zejména v levé polovině viroidní molekuly, v oblasti, která u příbuzných druhů tohoto parazita, například u viroidu bramboru, podmiňuje patogenní efekty. Při množení mutantů vznikají druhotné populace tohoto parazita, které mají význam pro jeho další evoluci. Práce má jak obecný teoretický význam pro pochopení mechanismu vniku značné proměnlivosti virů a virům podobných patogenů, tak praktický dopad pro analýzu nakažených rostlin chmele, u kterých dochází ke značným ztrátám produkce hořkých látek cenných pro výrobu piva.
Matoušek, J., Patzak,J., Orctová, L., Schubert, J., Vrba, L., Steger, G., Riesner, D.: The variability of hop latent viroid as induced upon heat treatment. - Virology, 287: 349-358 (2001).

5.19. Kadmium inhibuje epoxidaci diatoxantinu na diadinoxantin v xantofylovém cyklu mořské řasy phaeodactylum tricornutum.
BERTRAND, M., SCHOEFS, B., ŠIFFEL, P., ROHÁČEK, K., MOLNAR, I.

Kadmium je jedním z nejrozšířenějších těžkých kovů, které v posledních desetiletích znečisťují životní prostředí. Proto jsme ve spolupráci s Národním ústavem pro mořskou vědu a techniku ve Francii studovali vliv kadmia na fotosyntetické procesy mořské řasy Phaeodactylum tricornutum. K uměle pěstovaným řasám jsme přidávali 20 mg kadmia na litr roztoku mořské vody. Zjistili jsme, že kadmium specificky působí na jeden z ochranných mechanizmů, který si řasy a vyšší rostliny vyvinuly na ochranu proti poškození vysokými intenzitami světla, na tzv. xantofylový cyklus. Ten pomocí vratné, enzymaticky řízené, oxidace žlutých fotosyntetických barviv, xantofylů, reguluje účinnost fotosyntetických procesů. Práce dokazuje, že kadmium blokuje tento ochranný mechanizmus a zvyšuje tak citlivost těchto řas k jejich fotodestrukci.
Bertrand, M., Schoefs, B., Šiffel, P., Roháček, K., and Molnar, I.: Cadmium inhibits epoxidation of diatoxanthin to diadinoxanthin in the xanthophyll cycle of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. FEBS Lett. 508: 153-156 (2001).

5.20. Mapování repetitivních genomových sekvencí u vicia spp. pomocí metody microarray
NOUZOVÁ, M., NEUMANN, P., NAVRÁTILOVÁ, A., GALBRAITH, D.W., MACAS, J.

Modifikovaná technika DNA microarrays (nanášení a imobilizace vzorků DNA na mikroskopická sklíčka ve vysoké hustotě) byla použita na srovnávací analýzu repetitivní DNA u 13 druhů vikví a 6 dalších leguminóz. Díky vysoké účinnosti tohoto přístupu bylo možné srovnat zastoupení více než 1100 repetitivních sekvencí v genomech všech 19 druhů. Na základě takto získaných výsledků byly klony rozděleny do skupin, charakterizovaných výskytem ve (1) všech druzích rodů Vicia a Pisum, (2) pouze u některých druhů Vicia, a (3) přednostně u jednoho druhu. Následné sekvenování vybraných klonů ukázalo, že většina sekvencí ze skupiny (1) má původ v retroelementech, zatímco původ většiny klonů ze skupin (2) a (3) nelze na zakladě jejich sekvencí jednoznačně určit. Mezi klony ze skupiny (3) však byly identifikovány dvě tandemové repetice (satelitní DNA), z nichž první (VicTR-B) je specifická pro rod Vicia a druhá (S12) byla zjištěna pouze u druhu V. sativa. Sekvence S12 je dále zajímavá tím, že se kromě několika lokusů v interkalárních oblastech chromozómů nachazí také v intergenových spacerech genů pro rRNA.
Nouzová, M., Neumann, P., Navrátilová, A., Galbraith, D.W., Macas, J.: Microarray-based survey of repetitive genomic sequences in Vicia spp.. - Plant Molecular Biology 45: 229-244 (2001).

5.21. Úloha membránových mikrodomén v iniciaci časných signalizačních dějů na buněčném povrchu

Kovářová, M., Tolar, P., Arudchandran, R., Dráberová, L., Rivera, J., Dráber, P.:Structure-Function Analysis of Lyn Kinase Association with Lipid Rafts and Initiation of Early Signaling Events after Fce receptor I aggregation. Molecular And Cellular Biology 21: 8318 - 8328, 2001.

V současném období dochází k novému pohledu na strukturu a funkci buněčných membrán. Doposud se uvažovalo, že buněčné membrány jsou dvouvrstvou lipidů ve kterých jsou umístěny proteiny, jejichž pohyb je omezen pouze interakcemi s jinými proteiny. Nově se ukazuje, že lipidy buněčných membrán mají schopnost se seskupovat do tzv. membránových mikrodomén, které zajišťují přesnou prostorovou lokalizaci proteinů pro složité biochemické děje. Předkládaná práce využívá moderní molekulárně-genetické přístupy pro analýzu významu membránových mikrodomén při funkčních interakcích molekul. Konkrétně se jedná o receptor pro IgE u žírných buněk, který se aktivuje po vazbě komplexu IgE a antigenu a způsobuje uvolnění histaminu a dalších látek alergických reakcí. Prvním krokem aktivace je fosforylace tohoto receptoru Lyn kinázou. Práce přináší doklad, že pro správnou funkci musí být Lyn kináza zakotvena do plasmatické membrány. Asociace Lyn kinázy s agregovaným receptorem vyžaduje navíc zakotvení tohoto enzymu do membránových mikrodomén, které jsou definovány rezistencí k působení neiontových detergens. Naproti tomu fosforylace receptoru a uvolnění Ca2+ jsou na membránových mikrodoménách méně závislé. Na základě získaných výsledků byl postulován nový model aktivace IgE receptoru. Podle tohoto modelu frakce membránových lipidů lokalizuje Lyn kinázu do blízkosti IgE receptoru. Po vazbě komplexu IgE a antigenu dojde k agregaci receptorů a k jejich transfosforylaci kdy kináza v blízkosti jednoho receptoru využívá jako substrát další receptory v agregátu. Získané výsledky dokumentují strukturální úlohu membránových lipidů při interakci signálních molekul a přispívají k pochopení mechanismu aktivace žírných buněk. Toto poznání je nezbytným předpokladem pro racionální přístupy k léčbě pacientů s alergiemi.

5.22. Identifikace genetických lokusů, které kontrolují hladinu imunoglobulinu E

Badalová, J., Svobodová, M., Havelková, H., Vladimirov, V., Vojtíšková, J., Engová, J., Pilčík, T., Volf, P., Demant, P., Lipoldová, M.: Separation and mapping of multiple genes that control IgE level in Leishmania major infected mice. Genes Immun., in press

Systém imunoglobulinu E (IgE) a jeho receptorů se pravděpodobně vyvinul jako mechanismus chránící savce proti parazitům. Z dosud málo známých příčin však mohou další původně neškodné látky provokovat tento systém k alergické odpovědi.
V naší práci jsme rozdělili pomocí speciálního genetického systému rekombinantních kongenních kmenů myší komplexní genetickou regulaci exprese IgE, identifikovali devět nových genetických lokusů a popsali jejich interakce. Některé z těchto lokusů jsou zmapovány natolik přesně, že jsme na základě značné homologie mezi genetickými mapami člověka a myši získali informaci o homologických lidských genech. Potenciální význam těchto výsledků spočívá v možnosti hlubšího pochopení vzniku atopických reakcí a jejich rizika.

5.23. Antimetastatické účinky IL-2 a IL-12 u MHC I- nádorů indukovaných onkogeny EGIE7 HPV 16

Mikyšková, R., Bubeník, J., Mendoza, L., Vonka, V., Šmahel, M., Šímová, J., Jandlová, T.: Local cytokine treatment of HPV 16-associated tumours results in inhibition of their lung metastases. Clin. Exp. Metastasis 18: 581-587, 2001.

V modelovém systému nádoru MK16 indukovaného u myší onkogeny E6/E7 etiologického agens lidských karcinomů děložního čípku, viru HPV16, byl sledován účinek lokální léčby nádoru na plicní metastázy tohoto nádoru. Léčba nádorů MK16 peritumorálním (s.c.) podáním rekombinantního IL-2 nebo IL-12 inhibovala růst s.c. nádorového inokula a redukovala množství jeho plicních metastáz. Z léčebného hlediska je nález, že HPV16 asociované nádory jsou citlivé k cytokinové i genové IL-2 (IL-12) léčbě, významný především proto, že mezi tyto nádory patří 60% lidských karcinomů děložního čípku.

Vztah vyšší architektury genomu obratlovců a variability podmínek prostředí

Lososovité ryby (čeleď Salmonidae), tedy pstruzi, lososi, siveni, hlavatky, síhové a lipani, jsou skupinou ryb s nejlépe známými vývojovými vztahy, stejně jako s nejlépe prostudovanými chromozómy. Porovnání jednotlivých evolučních vývojových linií lososovitých ukazuje na významný paralelismus v charakteru jejich karyotypů, každá takováto linie obsahuje druhy s vysokým i nízkým počtem chromozómů. Druhy s nízkými počty chromozómů mají shodné buď anadromní (tažný) způsob života nebo jsou výsledkem vzniku druhů v jediném jezerním systému. Tuto skutečnost je možno vysvětlit selekcí pro zvýšení nebo naopak snížení genetických (genových i chromozómových) rekombinací, jak ostatně bylo již navrženo pro vysvětlení skutečnosti, že i u savců se vyskytují druhy jak s nízkými, tak vysokými počty chromozómů. Dva případy shodné diferenciace chromozómového obrazu u evolučně zcela rozdílných skupin tak poskytují obecnější vysvětlení složitého vztahu vyšší architektury genomu a variability podmínek prostředí, které tyto skupiny obývají.

Phillips, R.B., Ráb, P.: Chromosome evolution in the Salmonidae (Pisces): an update. - Biological Reviews 76: 1 - 25 (2001).