Oddělení transplantační imunologie

Oddělení je zaměřeno především na studium buněčných a molekulárních mechanismů specifické transplantační imunity a na využití získaných poznatků pro regulace imunitních reakcí s cílem zlepšení přežíváni geneticky odlišných transplantátů buněk a tkání. Základní model představují kultivované a cíleně diferenciované kmenové buňky (mesenchymální, limbální), které jsou přenášeny pomocí různých typů nanovlákenných nosičů za účelem reparace těžkých poškození kůže, očního povrchu a deficience limbálních kmenových buněk. Je využito široké spektrum metod buněčné a molekulární biologie, jako jsou tkáňové kultury, diferenciace kmenových buněk, studium regulace genové exprese (PCR, real time PCR), produkce a detekce cytokinů (ELISA, ELISPOT), průtoková cytometrie, MACS, Western blotting, experimentální modely transplantace kůže, oční rohovky, limbu a přenosy kmenových buněk. Hlavním cílem je testování získaných poznatků v preklinických modelech a jejich potenciální využití v klinické praxi (především u pacientů s těžkými poraněními očního povrchu).

Témata výzkumu

Transplantace orgánů nebo přenos kmenových buněk představují často jedinou možnost léčby pro zlepšení kvality života nebo dokonce pro jeho záchranu. Hlavní překážku v další rozvoji léčebných transplantací však představuje imunitní reakce proti cizím antigenům na transplantovaných buňkách. Proto je hlavním cílem našeho výzkumu získání nových a hlubších znalostí o buněčných a molekulárních mechanismech odhojovací imunitní reakce a hledání nových cest k cíleným imunoregulacím. Na modelu studie imunity v oku jsme ukázali, že úspěšná léčba vážně poškozeného očního povrchu vyžaduje přenos limbálních kmenových buněk, které regeneraci rohovky zajišťují. Proto je součástí našeho výzkumu studium kmenových buněk, které by mohly podporovat regeneraci očního povrchu a tak se podílet na zlepšení schopnosti vidět. V současné době jsme schopni úspěšně izolovat limbální nebo mezenchymální kmenové buňky a tyto buňky využít pro léčbu poškozeného rohovkového epitelu. Pro přenos těchto buněk na poškozený povrch oka úspěšně využíváme různé typy nanovlákenných konstruktů. Tyto nosiče vytvářejí optimální 3D strukturu vhodnou pro růst a přenos kmenových buněk. Naším hlavním cílem je poznání a využití mechanismů specifické imunitní reakce a také isolace, kultivace a následná transplantace ex vivo namnožených kmenových buněk a navržení a charakterizace nových postupů pro cílené imunoregulace umožňující přežívání geneticky odlišných buněk a orgánů.
Současné experimenty jsou také zaměřeny na studium možností cílené diferenciace mesenchymálních kmenových buněk v buňky poškozené tkáně a na jejich využití pro regeneraci poškozeného povrchu oka. Tento model představuje jednu z mnoha možností využití cíleně diferenciovaných kmenových buněk pro transplantace v regenerativní a reparativní medicíně.

Obr. 1: Experimentální model transplantace kůže u inbredních kmenů myší. Kožní alotransplantáty jsou po 10 dnů chráněny protektivními obvazy a po jejich odstranění je sledováno a vyhodnocováno přežívání transplantátů u různě léčených příjemců.

Obr. 2: Schéma regulační role cytokinů při vývoji fenotypově a funkčně odlišných subpopulací T lymfocytů.

Obr. 3: Studium in vitro indukce a vývoje regulačních T lymfocytů a prozánětlivých Th17 buněk pomocí průtokové cytometrie (FACS). Slezinné buňky z BALB/c myší byly kultivovány s ozářenými buňkami z B6 myší v přítomnosti determinujících cytokinů TGF-ß a IL-6. Procenta regulačních T buněk (Foxp3+ buňky) nebo Th17 buněk (RORγt+ buňky) byla stanovena pomocí FACS analýzy.

Obr. 4: Exprese genů pro imunologicky významné molekuly v odhojovaném alogenním nebo xenogenním transplantátu rohovky v experimentálním modelu u myši. Exprese genů v individuálních rohovkových transplantátech byla detekována pomocí PCR. Linie 1,2 – kontrolní (netransplantovaná) rohovka, 3,4 - syngenní transplantát rohovky, 5,6 – transplantát alogenní rohovky, 7,8 – xenotransplantát rohovky.

1. Regenerace těžce poškozeného povrchu oka pomocí kmenových buněk

Limbální a mesenchymální kmenové buňky byly expandovány in vitro a pomocí nanovlákenných nosičů byly přeneseny na poškozený oční povrch v experimentálních modelech u myši a u králíka. Terapeutický účinek kmenových buněk byl hodnocen histologicky a podle schopnosti kmenových buněk inhibovat expresi genů pro prozánětlivé molekuly jako je IL-2, IFN-gama, IL-17 nebo iNOS. Výsledky ukázaly využitelnostl kmenových buněk a nanovlákenných nosičů pro léčbu těžce poškozeného očního povrchu.

Spolupráce: Evropská oční klinika Lexum, Praha.

Schéma imunoregulačního a terapeutického působení mesenchymálních kmenových buněk (MSC). MSC působí řadou odlišných mechanismů. Mezi nejdůležitější patří jejich diferenciace v epiteliální buňky, imunomodulační působení a produkce celé řady růstových a trofických faktorů.

Struktura nanovlákenného nosiče (A) a růst mesenchymálních kmenových buněk na nanovlákenném nosiči (B, C). (A) Obraz nanovláken ze skenovacího elektronového mikroskopu (SEM), průměr nanovláken je 380 nm. (B) Myší MSC rostoucí na nanovláknech (červeně filamenty – F-aktin barvený falloidinem, modré – buněčná jádra barvená DAPI). (C) SEM obraz myších MSC rostoucích na nanovláknech.

Chemicky poškozené oko králíka pokryté nanovlákenným nosičem s kmenovými buňkami. Přenos nanovlákenného nosiče s kmenovými buňkami na poškozený oční povrch u králíka.

Publikace:

• Holáň, V., Javorková, E.: (2013) Mesenchymal stem cells, nanofiber scaffolds and ocular surface reconstruction. Stem Cells Rev. Rep. 9(5), 609-619. IF 4.523
• Čejková J., Tošan P., Čejka Č., Lenčová A., Zajícová A., Javorková E., Kubinová Š., Syková E., Holáň V.: (2013) Suppression of alkali-induced oxidative injury to the cornea by mesenchymal stem cells growing on nanofiber scaffolds and transferred onto the damaged corneal surface. Exp. Eye Res. 116, 312-323. IF 3.026
• Holáň, V., Javorková, E., Trošan, P.: The growth and delivery of mesenchymal and limbal stem cells using copolymer polyamide 6/12 nanofiber scaffolds. In: Wright, B. and Connon, C. J. (eds), Corneal Regenerative Medicine, Methods Mol. Biol., Humana Press – Springer, New York, London 2013, S. 187-199. ISBN 978-1-62703-431-9.

2. Role cytokinů při diferenciaci a funkci regulačních T a B buněk.

Bylo prokázáno, že odlišné cytokiny determinují vývoj a funkci regulačních T (Treg) a B (Breg) buněk. Zatímco TGF-beta determinuje vývoj a zesiluje imunosupresivní funkce Treg, u B lymfocytů tento cytokin tlumí vývoj Breg produkujících supresivní cytokin IL-10. Naproti tomu jiné dva cytokiny, IL-12 a IFN-gama, vývoj Breg silně zesilují. Výsledky tak ukazují odlišné role cytokinů při vývoji Treg a Breg a naznačují možnosti jejich využití pro efektivnější cílené regulace funkcí imunitního systému.

Spolupráce: Přírodovědecká fakulta UK, Praha

(A) Charakterizace populací B lymfocytů pomocí průtokové cytometrie. (B) Detekce buněk produkujících interleukin-10 pomoci techniky ELISPOT.

Publikace:

• Holáň, V., Zajícová, A., Javorková, E., Trošan, P., Chudičková, M., Pavlíková, M., Krulová, M.: (2013) Distinct cytokines balance the development of regulatory T cells and IL-10-producing regulatory B cells. Immunology. In press. IF 3.705
• Kubera M., Curzytek K., Duda W., Leskiewicz M., Basta-Kaim A., Budziszewska B., Roman A., Zajícová A., Holáň V., Szczesny E., Lason W., Maes M.:. (2013) A new animal model of (chronic) depression induced by repeated and intermittent lipopolysaccharide administration for 4 months. Brain Behav. Immun. 31, 96-104. IF 5.612
• Holáň, V., Krulová, M.: (2013) Common and small molecules as the ultimate regulatory and effector mediators of antigen-specific transplantation reactions. World J. Transplant. 3(4), 54-61. (nový časopis, zatím bez IF)

Laboratoř histochemie a farmakologie oka zkoumá příčiny špatně se hojících lézí předního očního segmentu při různých očních poraněních nebo onemocněních a možnosti regenerace tkání předního očního segmentu, zejména rohovky, s navrácením vizuálních funkcí. Pro hojení lézí předního očního segmentu je zvláštní pozornost věnována nanovláknům jako nosičů kmenových buněk a lékových forem. 

Assoc. Prof. Jitka Čejková, MD, DSc | Vedoucí laboratoře

E-mail: cejkova@biomed.cas.cz
Phone: +420 241 062 208

Vědečtí pracovníci:

Assoc. Prof. Jitka Čejková, MD, DSc
Čestmír Čejka, MSc, PhD

Techničtí pracovníci:

Jana Herlova

Pregraduální studenti:

Tomanová Aneta

Vašková Věrča

Švandová Ivana

Bayerová Martina

1. Nový regenerační faktor (RGTA, CACICOL20) pro hojení chronických rohovkových poranění a onemocnění

Prokázali jsme, že nový regenerační faktor (RGTA, CACIC0L20) je účinným prostředkem pro hojení rohovkových poranění, především špatně se hojících chronických vředů. Po aplikaci RGTA se exprese proteolytických enzymů (zejména metaloproteináz) a enzymů generujících oxid dusnatý v chronických ranách podstatně snížila, což bylo doprovázeno hojením rohovky bez výrazného zjizvení. Neovaskularizace rohovky a intraokulární zánět ustoupily. Rohovková průhlednost se obnovila zcela, anebo částečně.

Reprezentativní fotografie králičí rohovky s vředy, které se vyvinuly po poleptání rohovek 1.0 N Na0H a následně léčeny pomocí RGTA, anebo placebem. a - Kontrolní oko. Rohovka prvního oka jeden den po alkalickém poškození louhem sodným. Rohovková průhlednost je ztracena; b – Rohovka prvního oka jeden měsíc po poleptání (rohovka byla neléčena). Vyvinul se středový rohovkový vřed (šipka); d – Rohovka stejného oka po následném měsíčním léčením kapáním RGTA. Rohovkový vřed je zhojen (šipka); e - Rohovka druhého oka jeden den po poleptání louhem sodným. Rohovková transparence je ztracena; f - Stejná rohovka po jednom měsíci (rohovka bez léčení). Vytváří se středový rohovkový vřed (šipka); g - Stejná rohovka po dalším měsíci, kdy byla léčena placebem. Vřed je vyvinutý v celé tloučtce rohovky (šipka) a přetrvává. Rohovka je vaskularizovaná.

Exprese genů prozánětlivých cytokinů v rohovce poleptané louhem sodným a léčené RGTA anebo placebem. V rohovkách poleptaných louhem a léčených placebem, nebo RGTA byly stanoveny po 7 dnech (po 0.15 N NaOH) a po 21 dnech (po 1.0 N NaOH) exprese genů pro IL-1β (a), IFN-γ (b) a i-NOS (c) pomocí real-time PCR. Každý sloupcový graf představuje +- SD alespoň ze třech stanovení. Signifikantní rozdíly : *P<0.05, ***P<0.01 mezi rohovkami léčenými RGTA a placebem.

 

Spolupráce: Thea Laboratoires, Clermont Ferrand, France (Dr.Celine Olmiere), Oddělení transplantační imunologie (prof. RNDr Vladimír Holáň, DrSc.)

Publikace: Cejkova J, Olmiere C, Cejka C, Trosan P, Holan V (2013). The healing of alkali-injured cornea is stimulated by a novel matrix regenerating agent (RGTA, CACICOL20): a biopolymer mimicking heparan sulfates reducing proteolytic, oxidative and nitrosative damage. Histol Histopathol 2013 Oct 9. (29,457-78,2014).IF 2,281.

 

2. Králičí kmenové mesenchymové buňky na nanovláknových nosičích hojí oxidační poškození rohovky, vyvolané louhem sodným

Králičí mesenchymové kmenové buňky na nanovláknových nosičích přeneseny na povrch poškozeného oka zhojily oxidační poškození, vyvolané alkalickým poraněním. Alkalické poranění oka vyvolá prooxidační/antioxidační nerovnováhu, vedoucí v rohovce ke zvýšenému množství prozánětlivých cytokinů a k tvorbě peroxynitritu a malondialdehydu. Mesenchymové kmenové buňky signifikantně redukovaly oxidační poškození rohovky a zhojily rohovku s navrácením průhlednosti.

Reprezentativní fotografie rohovek, poleptaných louhem sodným (0.15 N NaOH) (A-G), rohovková neovaskularizace (H) a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) (I) 15. den po poranění. A - zdravé, kontrolní oko; B - okamžitě po poškození louhem je rohovka zašedlá; C - poraněná rohovka, na kterou byly přeneseny mesenchymální kmenové buňky na nanovláknitých nosičích a přišity ke spojivce; D, E - V neléčené rohovce se vyvinula vysoká neovaskularizace (stupeň 4) (D), nebo středně mohutná neovaskularizace (stupeň 3) (E). Naopak, v rohovce poškozené a léčené pomocí MSCs se vyvinula slabá neovaskularizace (stupeň 2) (F), anebo byly v rohovce shledány pouze ojedinělé cévy (stupeň 1) (G). H - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace počítáním cév. I - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace pomocí real-time PCR (exprese genů pro VEGF).

Barvení Haematoxylin-eosinem (HE) (a,b), exprese vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF) (c-f) a makrofágů (g-j) 15. den po poškození rohovky louhem sodným (0.15 N NaOH). a – V neléčené rohovce jsou ve vaskularizovaném stromatu (šipky) četné zánětlivé buňky; b – V rohovce léčené MSCs je počet zánětlivých buněk redukován. Cévy nejsou přítomny; c, e – V poškozené neléčené rohovce je exprese VEGF silně vyjádřena , zatím co v rohovce poškozené, ale léčené MSCs, je exprese VEGF nízká (d). V kontrolní rohovce není exprese přítomna kromě slabé exprese v epitelu (f). V poškozené neléčené rohovce je velké množství makrofágů (g, i), zatím co v rohovce poškozené a léčené MSCs jsou v rohovkovém stromatu pouze ojedinělé makrofágy. j – rohovka kontrolní, bez makrofágů.

1. Nebezpečí dlouhodobého pobytu na slunci pro lidské oko

Solární UVB záření vyvolá v rohovce intrakorneální zánět, zvýšenou rohovkovou hydrataci a změnu transmise světla rohovkou. Tyto změny jsou doprovázeny mlhavým viděním, změnou ostrosti vidění. V pokusech na králičí rohovce a porovnáním dávek záření experimentálních s dávkami UVB záření udávanými v literatuře, dopadajícími na lidskou rohovku ze slunečního světla jsme prokázali, že celodenní pobyt na slunci po čtyři po sobě jdoucí dny je pro člověka nebezpečný a může vyvolat trvalé změny v optických vlastnostech oka.

Obr. Grafy (Obr. 1. a Obr. 2.) vyjadřují průměrná absorpční spektra králičí rohovky, vyjádřená jako průběhy transmitance resp. absorbance po 4 dnech ozařování rohovky při denní dávce 0.5 J/cm2 nebo 1.0 J/cm2 a po dvou měsících hojení rohovky v porovnání k průměrným hodnotám absorpčních spekter normální rohovky (spektra jsou relevantní nad 300 nm). Z průběhu spekter vyplývá, že po opakované vyšší dávce UVB záření se průchod světla rohovkou neobnoví k původním hodnotám. Dávky 0.5 J/cm2 a 1.0 J/cm2 odpovídají u člověka pobytu na slunci a přímé expozici oka (rohovky) UVB záření po dobu 5 a 10 hodin.

2. Metoda impresních cytologií epiteliálních buněk rohovky jako citlivá diagnostická metoda

Porovnáváním vhodných imunohistochemických márkrů v kryostatových řezech králičí rohovky se stejnými márkry detekovanými na impresních rohovkových cytologiích na Millicelových membránách jsme zjistili, že impresní cytologie jsou velmi citlivou metodou pro diagnostiku rohovkových poranění anebo onemocnění. Prokázali jsme to na experimentálním poškození rohovky UVB zařením, kde trehaloza účinně zrychlila hojení rohovky a snížila rohovkovou neovaskularizaci. Metoda je využitelná v humánní medicině. Podává obraz rohovkového poškození, aniž by pacienta zatížila náročným vyšetřením.

Porovnání imunohistochemické detekce plasminogen aktivátoru urokinázového typu (u-PA) v kryostatových řezech králičí rohovky s detekcí u-PA v impresních cytologiích buněk rohovkového epitelu Obr. Imunohistochemické detekci plasminogen aktivátoru urokinázového typu (u-PA) v kryostatových řezech rohovkového epitelu (a, c, e, g, i, k, m) odpovídá detekce u-PA na impresních cytologiích buněk rohovkového epitelu (b, d, f, h, j, l, n). Na obrázku je to ukázáno u rohovky ozářené UVB zářením a lokálně léčené trehalozou. Ozáření rohovky UVB paprsky vyvolá vysokou expresi U-PA (a, b) v porovnání k normální rohovce (k, l), kde barvení u-PA je velmi nízké. Trehaloza, disacharid glukozy, snižuje expresi u-PA (e, f – po jednom týdnu aplikace trehalozy na oko, i, j – po dvou týdnech aplikace) v porovnání s aplikací fyziologického roztoku na rohovku, kde exprese u-PA je podstatně vyšší (c, d – po jednom týdnu aplikace, g, h – po dvou týdnech aplikace na oko). Na obrázku m, n je negativní kontrola (inkubační roztok bez primární protilátky). Pouze jádra se barví dobarvením (haematoxylinem).