Laboratoře

Laboratoř vývojové biologie

Vedoucí oddělení:

Kaňka Jiří , RNDr., DrSc.

Činnost oddělení:

Laboratoř vývojové biologie se zaměřuje na expresi jednotlivých genů a proteinů v průběhu meiotické maturace oocytů a časného embryonálního vývoje savců. Jako model používáme oocyty prasete a oocyty a embrya skotu, kultivované v podmínkách in vitro.

Během růstu je zrání oocytů zablokováno v profázi I. meiotického dělení, avšak oocyt získává v několika krocích schopnost dokončit meiotické zrání – meiotickou kompetenci. Tyto meioticky kompetentní oocyty však zůstávají I nadále blokovány v meiotické profázi a znovuzahájí zrání in vivo až po preovulační vlně luteinizačního hormonu (LH), nebo in vitro, po uvolnění z folikulů do vhodného kultivačního media. Znovuzahájení meiozy je regulováno na úrovni oocytu post-translačními mechanizmy a nezávisí na aktivaci genové exprese v oocytu. Nicméně, preovulační vlna LH způsovuje dramatickou změnu genové exprese v somatických buňkách obklopujících oocyt, tedy v buňkách granulózních a kumulárních. Tyto změny genové exprese jsou regulovány širokou sítí signálních drah aktivovaných ve folikulárních buňkách pomocí LH.

Vývoj savčího embrya navazuje na maturaci oocytů a v období před implantací je charakterizován třemi hlavními vývojovými přechody, ke kterým dochází po oplození oocytu – přechod od oocytární kontroly ke kontrole vývoje embryonálním genomem (zygotic gene activation – ZGA), kompaktace (jejímž výsledkem je polarizovaný epitel) a diferenciace moruly do blastocysty. ZGA představuje proces, který zahrnuje degradaci maternální mRNA v koordinaci s počátkem transkripce a následné translace mRNA syntetizované na základě embryonálního genomu. K aktivaci embryonálního genomu u myši dochází již na 2-buněčném stadiu, tedy velmi časně. Této hlavní aktivaci dokonce předchází transkripce začínající již na 1-buněčném stadiu, v samčím pronukleu. U embrya skotu je genom plně aktivován v pozdním 2-buněčném stadiu, existují však práce, popisující „minor activation“ již na 2-buněčném stadiu. Na rozdíl od myši, kde zrání oocytů a reprogramace genové exprese jsou dobře popsána, u oocytů a embryí prasete a skotu stále zůstává celá řada nerozřešených otázek. Oocyty a embrya těchto druhů jsou přitom lepším modelem pro oogenezi a embryogenezi člověka než oocyty a embrya hlodavců.

V současnosti se naše laboratoř soustřeďuje na dvě hlavní oblasti výzkumu:

Meiotická maturace prasečích oocytů.

Naše laboratoř se dlouhodobě zabývá molekulárními mechanizmy zrání oocytů savců a to zejména způsobem, jakým somatické folikulární buňky regulují meiotický blok a znovuzahájení meiozy oocytů. Pomocí polymerázové řetězové reakce, mikročipové analýzy a immunoblotingu identifikujeme na modelu prasete geny a proteiny granulozních a kumulárních buněk, které se účastní regulace meiotického zrání oocytů. Zvláštní pozornost věnujeme charakterizaci signálních proteinů a signálních kaskád, které jsou aktivovány ve folikulu gonadotropními hormony a modifikovány lokálně produkovanými růstovými faktory.

Role cyklického guanosine monophosphate (cGMP)

Epidermální růstový faktor (EGF)-like peptid

(1) Oocyt-kumulární komplexy prasete po kultivaci in vitro v médium s dbcAMP.

(2) Expandovaný ooocyt-kumulární komplex prasete izolovaný z preovulačního folikulu prasete 24 h po aplikaci hCG.

(1) Detekce genové exprese pomocí mikročipové technologie.

(2) Detekce mitogeny aktivované proteinkinázy v oocyt-kumulárních komplexech prasete kultivovaných v médiu s FSH a 8-CPT-cGMP.

Preimplantační vývoj skotu

Role nucleophosminu

Nucleophosmin byl vybrán pro tuto studii jako gen, který je s vysokou pravděpodobností důležitý pro preimplantační vývoj skotu. Nalezli jsme totiž, že embryonální transkripce nucleophosminu začíná v průběhu hlavní vlny aktivace embryonálního genomu, což naznačuje jeho nezbytnost pro další vývoj. Zjistili jsme, že úroveň mRNA pro nucleophosmin se snižuje z MII stadia do časného 8-buněčného stadia a začíná se opět zvyšovat v pozdním 8-buněčném stadiu. Toto zvýšení je citlivé na α-amanitin (inhibitor RNA polymerázy II) a představuje tak začátek transkripce z embryonálního genomu. Následně jsme zjišťovali pomocí RNA interference vliv umlčení mRNA pro nucleophosmin na časnou embryogenezi. Naše výsledky ukazují, že malé množství nucleophosminu je umlčeno v průběhu celého preimplantačního vývoje a umožňuje tak vývoj embrya do stadia blastocysty.

SCF komplex

V současnosti nejdůležitější oblast našeho výzkumu v oblasti embryonálního vývoje skotu představuje ubikvitinace. Soustředili jsme se na komplex Skp1-Cullin1-Fbox (SCF), expresi jeho jednotlivých kompotent (Cullin1, Skp1, Rbx1) a jeho podílu na degradaci maternálních proteinů. Naše doposud dosažené výsledky ukázaly, že embryonální exprese všech těchto genů začíná v časných stadiích vývoje. Zvláště Cullin1 je aktivován velice časně, již na 4-buněčném stadiu. Geny, účastnící se ubikvitinace, jsou obvykle aktivovány na 8-buněčném stadiu, časná aktivace Cullin1 tedy předpokládá jeho nezbytnost pro aktivaci embryonálního genomu. Analýza lokalizace jednotlivých proteinů ukázala zajímavé výsledky hlavně na stadiu blastocysty, kde je viditelná lokalizace exprese proteinu a aktivace SCF komplexu do buněk trofektodermu.

Blastocysta skotu po ošetření Duolink In situ PLA analýzou. PLA signal znázorňuje interakce CUL1 a SKP1 (červeně), jádra (modře). Pořízeno konfokálním mikroskopem Leica SP 5.

Polymerace tubulinu u embrya skotu obarvena immunofluorescenční metodou. Alpha-tubulin (zeleně), nukleofosmin (červeně), jádra (modře). Pořízeno konfokálním mikroskopem TCS SP. Toralová et al. 2012, Bovine preimplantation embryos with silenced nucleophosmin mRNA are able to develop until the blastocyst stage. Reproduction 144, 349-359.