Oddělení transplantační imunologie

Výzkum Oddělení transplantační imunologie je zaměřen na přípravu kmenových buněk a jejich využítí k léčbě těžkých poranění nebo doposud neléčitelných onemocnění. Kmenové buňky jsou množeny v tkáňových kulturách a pomocí nanovlákenných nosičů jsou přenášeny na poškozené nebo nefunkční tkáně. Hodnocena je schopnost kmenových buněk inhibovat nežádoucí zánětlivou reakci a podporovat hojení nemocných tkání nebo orgánů. Cílem výzkumu je poznat mechanismy specifické imunitní reakce po transplantaci kmenových buněk a využít tyto poznatky k zesílení terapeutických účinků transplantovaných buněk. Kombinace znalostí mechanismů transplantačních reakcí, nanotechnologií a využití kmenových buněk umožňuje navrhovat a testovat nové léčebné postupy, které povedou ke zvýšení kvality života nebo dokonce k jeho záchraně.

1.Srovnávací studie charakterizující vlastnosti a léčebný potenciál mesenchymálních kmenových buněk a tkáňově specifických limbálních kmenových buněk

Byla charakterizována a porovnána schopmost mesenchymálních kmenových buněk (MSC) a limbálních kmenových buněk (LSC) produkovat důležité imunoregulační molekuly a modulovat imunitní reakce. Navíc, terapeutický potenciál těchto kmenových buněk byl studován v modelu léčby chemicky poškozeného povrchu oka u králíka. Bylo pozorováno, že MSC mají srovnatelné léčebné vlastnosti jako tkáňově specifické LSC. Výsledky tak ukázaly, že MSC mohou nahradit tkáňově specifické LSC v případech, kdy LSC zcela chybí nebo jsou jen těžko dostupné.

Charakterizace funkčních vlastností MSC. Buňky byly kultivovány nestimulované a nebo byly stimulované LPS, IFN-γnebo LPS plus IFN-γ. Schopnost buněk exprimovat geny pro významné imunoregulační molekuly byla detekována pomocí real-time PCR.

Srovnání léčebného potenciálu MSC a LSC. Pomocí nanovlákeného nosiče byly kmenové buňky přeneseny na poškozený povrch oka a byl hodnocen jejich léčebný potenciál. Obrázek ukazuje zdravé oko králíka, oko krátce po poškození louhem, poškozené neléčené oko dva týdny po poškození a nebo poškozené oko léčené pomocí MSC nebo LSC.

Publikace:

Holáň V., Trošan P., Čejka Č., Javorková E., Zajícová A., Heřmánková B., Chudíčková M, Čejková J.: A comparative study of the therapeutic potential of mesenchymal stem cells and limbal epithelial stem cells for ocular surface reconstruction. Stem Cells Translat. Med. 4, 1052-1063, 2015. IF 5.709.
Heřmanková B., Zajícová A., Javorková E., Chudíčková M., Trošan P., Hájková M., Krulová M., Holáň V.: Suppression of IL-10 production by activated B cells via a cell contact-dependent cyclooxygenase-2 pathway upregulated in IFN-γ-treated mesenchymal stem cells. Immunobiology 221, 129-136, 2016. IF 3.044. 

1. Studium vlivu cytokinů na migraci a léčebný potenciál mesenchymálních kmenových buněk v modelu lokální zánětlivé reakce po poškození oka

Na modelu chemicky poškozeného povrchu oka jsme prokázali, že systémově (intravenózně) podané mesenchymální kmenové buňky (MSC) selektivně migrují do místa poškození a tam potlačují infiltraci prozánětlivými buňkami imunitního systému. Schopnost MSC potlačovat rozvoj lokální zánětlivé reakce může být modulována jejich preinkubací s cytokiny, které také determinují vývoj T a B lymfocytů a modulují sekreční profil MSC. Výsledek ukazuje možnosti systémového podání MSC i pro supresi a léčbu lokální zánětlivé reakce.

Fenotypová charakterizace MSC (A), značení MSC činidlem PKH26 (B, C) a průkaz značených MSC migrovaných do poškozeného oka (D).

Spolupráce: Přírodovědecká fakulta UK v Praze

Publikace:

Javorková E, Trošan P, Zajícová A, Krulová M, Hajková M, Holáň V, (2014): Modulation of the early infl ammatory microenvironment in alkaliburned eye by systemically administered interferon treated mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 23, 2490-2500. IF 4.202

Holáň V, Zajícová A, Javorková E, Trošan P, Chudičková M, Pavlíková M, Krulová M, (2014): Distinct cytokines balance the development of regulatory T cells and IL-10-producing regulatory B cells. Immunology 141, 577-586. IF 3.3735 

1. Regenerace těžce poškozeného povrchu oka pomocí kmenových buněk

Limbální a mesenchymální kmenové buňky byly expandovány in vitro a pomocí nanovlákenných nosičů byly přeneseny na poškozený oční povrch v experimentálních modelech u myši a u králíka. Terapeutický účinek kmenových buněk byl hodnocen histologicky a podle schopnosti kmenových buněk inhibovat expresi genů pro prozánětlivé molekuly jako je IL-2, IFN-gama, IL-17 nebo iNOS. Výsledky ukázaly využitelnostl kmenových buněk a nanovlákenných nosičů pro léčbu těžce poškozeného očního povrchu.

Spolupráce: Evropská oční klinika Lexum, Praha.

Schéma imunoregulačního a terapeutického působení mesenchymálních kmenových buněk (MSC). MSC působí řadou odlišných mechanismů. Mezi nejdůležitější patří jejich diferenciace v epiteliální buňky, imunomodulační působení a produkce celé řady růstových a trofických faktorů.

Struktura nanovlákenného nosiče (A) a růst mesenchymálních kmenových buněk na nanovlákenném nosiči (B, C). (A) Obraz nanovláken ze skenovacího elektronového mikroskopu (SEM), průměr nanovláken je 380 nm. (B) Myší MSC rostoucí na nanovláknech (červeně filamenty – F-aktin barvený falloidinem, modré – buněčná jádra barvená DAPI). (C) SEM obraz myších MSC rostoucích na nanovláknech.

Chemicky poškozené oko králíka pokryté nanovlákenným nosičem s kmenovými buňkami. Přenos nanovlákenného nosiče s kmenovými buňkami na poškozený oční povrch u králíka.

Publikace:

• Holáň, V., Javorková, E.: (2013) Mesenchymal stem cells, nanofiber scaffolds and ocular surface reconstruction. Stem Cells Rev. Rep. 9(5), 609-619. IF 4.523
• Čejková J., Tošan P., Čejka Č., Lenčová A., Zajícová A., Javorková E., Kubinová Š., Syková E., Holáň V.: (2013) Suppression of alkali-induced oxidative injury to the cornea by mesenchymal stem cells growing on nanofiber scaffolds and transferred onto the damaged corneal surface. Exp. Eye Res. 116, 312-323. IF 3.026
• Holáň, V., Javorková, E., Trošan, P.: The growth and delivery of mesenchymal and limbal stem cells using copolymer polyamide 6/12 nanofiber scaffolds. In: Wright, B. and Connon, C. J. (eds), Corneal Regenerative Medicine, Methods Mol. Biol., Humana Press – Springer, New York, London 2013, S. 187-199. ISBN 978-1-62703-431-9.

2. Role cytokinů při diferenciaci a funkci regulačních T a B buněk.

Bylo prokázáno, že odlišné cytokiny determinují vývoj a funkci regulačních T (Treg) a B (Breg) buněk. Zatímco TGF-beta determinuje vývoj a zesiluje imunosupresivní funkce Treg, u B lymfocytů tento cytokin tlumí vývoj Breg produkujících supresivní cytokin IL-10. Naproti tomu jiné dva cytokiny, IL-12 a IFN-gama, vývoj Breg silně zesilují. Výsledky tak ukazují odlišné role cytokinů při vývoji Treg a Breg a naznačují možnosti jejich využití pro efektivnější cílené regulace funkcí imunitního systému.

Spolupráce: Přírodovědecká fakulta UK, Praha

(A) Charakterizace populací B lymfocytů pomocí průtokové cytometrie. (B) Detekce buněk produkujících interleukin-10 pomoci techniky ELISPOT.

Publikace:

• Holáň, V., Zajícová, A., Javorková, E., Trošan, P., Chudičková, M., Pavlíková, M., Krulová, M.: (2013) Distinct cytokines balance the development of regulatory T cells and IL-10-producing regulatory B cells. Immunology. In press. IF 3.705
• Kubera M., Curzytek K., Duda W., Leskiewicz M., Basta-Kaim A., Budziszewska B., Roman A., Zajícová A., Holáň V., Szczesny E., Lason W., Maes M.:. (2013) A new animal model of (chronic) depression induced by repeated and intermittent lipopolysaccharide administration for 4 months. Brain Behav. Immun. 31, 96-104. IF 5.612
• Holáň, V., Krulová, M.: (2013) Common and small molecules as the ultimate regulatory and effector mediators of antigen-specific transplantation reactions. World J. Transplant. 3(4), 54-61. (nový časopis, zatím bez IF)

Laboratoř histochemie a farmakologie oka zkoumá příčiny špatně se hojících lézí předního očního segmentu při různých očních poraněních nebo onemocněních a možnosti regenerace tkání předního očního segmentu, zejména rohovky, s navrácením vizuálních funkcí. Pro hojení lézí předního očního segmentu je zvláštní pozornost věnována nanovláknům jako nosičů kmenových buněk a lékových forem. 

Assoc. Prof. Jitka Čejková, MD, DSc | Vedoucí laboratoře

E-mail: cejkova@biomed.cas.cz
Phone: +420 241 062 208

Vědečtí pracovníci:

Assoc. Prof. Jitka Čejková, MD, DSc
Čestmír Čejka, MSc, PhD

Techničtí pracovníci:

Jana Herlová

Pregraduální studenti:

Tomanová Aneta

Vašková Věrča

Švandová Ivana

Bayerová Martina

1. Význam oxidačního stresu při poškození rohovky

Oxidační stres se významně podílí na iniciaci i propagaci rohovkových změn po jejím poranění, např. po ozáření UV paprsky nebo poleptání chemickými sloučenínami, zejména louhy. V rohovce po jejím poranění vzniká nerovnováha mezi oxidanty a antioxidanty, jsou inhibovány inhibitory proteáz, zejména matrix metalloproteináz. Rozvíjí se intrakorneální zánět, průhlednost rohovky je ztracena a do rohovky vrůstají cévy.

Oxidační stres hraje důležitou úlohu v očních poraněních a onemocněních. Jeho včasná diagnostika je rozhodující pro způsob léčení. Prokázali jsme, že otisky rohovkových buněk s imunohistochemickými márkry umožní rychlou a snadnou diagnostiku oxidačních poškození, využitelnou v klinice. Metoda impresní cytologie je tedy velmi vhodnou diagnostickou metodou nejen pro určení pokročilosti poškození rohovky např. u suchého oka, jak jsme dříve navrhli, ale též velmi citlivě detekuje oxidační změny v rohovce. Exprese nitrotyrosinu, márkru oxidačního stresu, a – v otisku rohovkových buněk po jejich poškození, b – v kryostatovém řezu rohovky po jejím poškození, c – negativní exprese nitrotyrosinu v otisku rohovkových buněk, zdravé oko d – negativní exprese nitrotyrosinu v kryostatovém řezu rohovky, zdravé oko. Podobně e – h je exprese malondialdehydu, márku peroxidace lipidů v otisku a kryostatovém řezu rohovky poškozené a zdravé.

Porovnávali jsme úlohu oxidačního stresu v rohovce po jejím různém poškozením, např. UV zářením, po alkalickém poleptání, atd. V rohovce vzniká nerovnováha mezi oxidanty a antioxidanty (oxidační stres), vedoucí k inhibici přírodně se vyskytujících inhibitorů matrix metalloproteináz a serinových proteáz. Indukují a aktivují se destruktivní proteázy, pro-zánětlivé cytokiny a syntázy oxidu dusnatého. V rohovce detekujeme nitrotyrosin a malondialdehyd (márkry oxidačního stresu a peroxidace lipidů). Intrakorneální zánět se rozvíjí a vzniká neovaskularizace rohovky.

Publikace: Čejková J, Čejka C, (2015): The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histol Histopathol. 11611– Epub. [ahead of print] IF 2.236

1. Nový regenerační faktor (RGTA, CACICOL20) pro hojení chronických rohovkových poranění a onemocnění

Prokázali jsme, že nový regenerační faktor (RGTA, CACIC0L20) je účinným prostředkem pro hojení rohovkových poranění, především špatně se hojících chronických vředů. Po aplikaci RGTA se exprese proteolytických enzymů (zejména metaloproteináz) a enzymů generujících oxid dusnatý v chronických ranách podstatně snížila, což bylo doprovázeno hojením rohovky bez výrazného zjizvení. Neovaskularizace rohovky a intraokulární zánět ustoupily. Rohovková průhlednost se obnovila zcela, anebo částečně.

Reprezentativní fotografie králičí rohovky s vředy, které se vyvinuly po poleptání rohovek 1.0 N Na0H a následně léčeny pomocí RGTA, anebo placebem. a - Kontrolní oko. Rohovka prvního oka jeden den po alkalickém poškození louhem sodným. Rohovková průhlednost je ztracena; b – Rohovka prvního oka jeden měsíc po poleptání (rohovka byla neléčena). Vyvinul se středový rohovkový vřed (šipka); d – Rohovka stejného oka po následném měsíčním léčením kapáním RGTA. Rohovkový vřed je zhojen (šipka); e - Rohovka druhého oka jeden den po poleptání louhem sodným. Rohovková transparence je ztracena; f - Stejná rohovka po jednom měsíci (rohovka bez léčení). Vytváří se středový rohovkový vřed (šipka); g - Stejná rohovka po dalším měsíci, kdy byla léčena placebem. Vřed je vyvinutý v celé tloučtce rohovky (šipka) a přetrvává. Rohovka je vaskularizovaná.

Exprese genů prozánětlivých cytokinů v rohovce poleptané louhem sodným a léčené RGTA anebo placebem. V rohovkách poleptaných louhem a léčených placebem, nebo RGTA byly stanoveny po 7 dnech (po 0.15 N NaOH) a po 21 dnech (po 1.0 N NaOH) exprese genů pro IL-1β (a), IFN-γ (b) a i-NOS (c) pomocí real-time PCR. Každý sloupcový graf představuje +- SD alespoň ze třech stanovení. Signifikantní rozdíly : *P<0.05, ***P<0.01 mezi rohovkami léčenými RGTA a placebem.

 

Spolupráce: Thea Laboratoires, Clermont Ferrand, France (Dr.Celine Olmiere), Oddělení transplantační imunologie (prof. RNDr Vladimír Holáň, DrSc.)

Publikace: Cejkova J, Olmiere C, Cejka C, Trosan P, Holan V (2013). The healing of alkali-injured cornea is stimulated by a novel matrix regenerating agent (RGTA, CACICOL20): a biopolymer mimicking heparan sulfates reducing proteolytic, oxidative and nitrosative damage. Histol Histopathol 2013 Oct 9. (29,457-78,2014).IF 2,281.

 

2. Králičí kmenové mesenchymové buňky na nanovláknových nosičích hojí oxidační poškození rohovky, vyvolané louhem sodným

Králičí mesenchymové kmenové buňky na nanovláknových nosičích přeneseny na povrch poškozeného oka zhojily oxidační poškození, vyvolané alkalickým poraněním. Alkalické poranění oka vyvolá prooxidační/antioxidační nerovnováhu, vedoucí v rohovce ke zvýšenému množství prozánětlivých cytokinů a k tvorbě peroxynitritu a malondialdehydu. Mesenchymové kmenové buňky signifikantně redukovaly oxidační poškození rohovky a zhojily rohovku s navrácením průhlednosti.

Reprezentativní fotografie rohovek, poleptaných louhem sodným (0.15 N NaOH) (A-G), rohovková neovaskularizace (H) a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) (I) 15. den po poranění. A - zdravé, kontrolní oko; B - okamžitě po poškození louhem je rohovka zašedlá; C - poraněná rohovka, na kterou byly přeneseny mesenchymální kmenové buňky na nanovláknitých nosičích a přišity ke spojivce; D, E - V neléčené rohovce se vyvinula vysoká neovaskularizace (stupeň 4) (D), nebo středně mohutná neovaskularizace (stupeň 3) (E). Naopak, v rohovce poškozené a léčené pomocí MSCs se vyvinula slabá neovaskularizace (stupeň 2) (F), anebo byly v rohovce shledány pouze ojedinělé cévy (stupeň 1) (G). H - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace počítáním cév. I - Kvantifikace rohovkové neovaskularizace pomocí real-time PCR (exprese genů pro VEGF).

Barvení Haematoxylin-eosinem (HE) (a,b), exprese vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF) (c-f) a makrofágů (g-j) 15. den po poškození rohovky louhem sodným (0.15 N NaOH). a – V neléčené rohovce jsou ve vaskularizovaném stromatu (šipky) četné zánětlivé buňky; b – V rohovce léčené MSCs je počet zánětlivých buněk redukován. Cévy nejsou přítomny; c, e – V poškozené neléčené rohovce je exprese VEGF silně vyjádřena , zatím co v rohovce poškozené, ale léčené MSCs, je exprese VEGF nízká (d). V kontrolní rohovce není exprese přítomna kromě slabé exprese v epitelu (f). V poškozené neléčené rohovce je velké množství makrofágů (g, i), zatím co v rohovce poškozené a léčené MSCs jsou v rohovkovém stromatu pouze ojedinělé makrofágy. j – rohovka kontrolní, bez makrofágů.