Strukturně - funkční analysa a inhibice mutantů HIV proteasy vzniklé pod selekčním tlakem u HIV-pozitivních pacientů léčených inhibitory proteasy

Odhaduje se, že infekce virem způsobujícím selhání imunity u lidí (HIV) má na svědomí každým rokem 4.9 milionů úmrtí. Z tohoto důvodu je vývoj látek blokujících HIV replikaci stále velmi důležitý. Jedna skupina virostatik, inhibitory proteasy z viru HIV, je obzvlášt účinná, přestože schopnost viru mutovat vede i u nich k rychlému vytvoření rezistence. V našem široce zaměřeném projektu sledujeme HIV pozitivní pacienty léčené inhibitory proteasy ve Fakultní nemocnici Bulovka, sekvenujeme jejich virovou DNA, exprimujeme příslušné virové proteasy a strukturně a enzymologicky je charakterizujeme. Cílem našeho výzkumu je prostudovat vývoj virové resistence na molekulární úrovni a identifikovat nové inhibitory, schopné zablokovat i rezistentní virové druhy.

[relevantní publikace: Cígler et al. (2005), Weber et al. (2002)].

Exprese, buněčná lokalizace, struktura, funkce a inhibice glutamátkarboxypeptidasy II, neuropeptidasy a rakovinného markeru

Glutamátkarboxypeptidasa II je membránově vázaná peptidasa, exprimovaná v celé řadě tkání jako jsou ledviny, prostata a mozek. V lidském mozku tento enzym štěpí neuropřenašeč N-acetyl- aspartát glutamát (NAAG) a uvolňuje tak aminokyselinu glutamát, která hraje důležitou roli v mnoha patologických procesech, jako jsou například neurologická poškození v důsledku mozkové mrtvice, diabetická neuropatie, Alzheimerova choroba atd. Pokusy na zvířatech prokázaly, že GCPII je důležitým cílem pro vývoj nových neuroprotektivních léků. Forma enzymu, vyskytující se v prostatě, známá jako Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA) je důležitým rakovinným markerem. Exprimovali jsme tento protein v hmyzích buňkách a enzymologicky ho charakterizovali. Zaměřili jsme se zvláště na zmapování oblastí proteinu, nezbytných a dostačujících pro enzymovou aktivitu, analyzovali jsme glykosylaci enzymu, objasnili jeho substrátovou specifitu a určili (ve spolupráci) jeho rentgenovou strukturu (jak volného, tak v komplexu s různými specifickými inhibitory). Za použití nové, specifické monoklonální protilátky jsme analyzovali expresi enzymu v různých lidských a zvířecích tkáních s cílem objasnit dosud neznámou ne-proteolytickou roli GCPII při vzniku nádorů.

[relevantní publikace: Šácha et al. (2007), Mesters et al. (2006), Bařinka et al. (2002)].

Serinová racemasa z lidského mozku: neočekávaná role D-aminokyseliny v centrálním nervovém systému

Téměř všechny proteiny v živém organismu se skládají z L-aminokyselin. Teprve velmi nedávno bylo objeveno, že D-forma aminokyseliny serinu je ve vysoké koncentraci přítomna v mozcích savců. Ukázalo se, že D-serin působí jako spoluaktivátor v "glycinátovém místě" receptoru pro N-methyl-D-aspartát (NMDA). Tyto receptory v centrálním nervovém systému savců jsou rozhodující pro mnoho fyziologických procesů, včetně vývoje mozku, učení a paměti. Nadměrná aktivace NMDA receptorů vede k neurologické smrti a přispívá k post-ischemickému poškození mozku a neuropatologiím. Inhibitory serinové racemasy se tak stávají možnými léky pro neurodegenerativní onemocnění, včetně Alzheimerovy a Parkinsonovy nemoci. D-serin je v mozku syntetisován enzymem serinovou racemasou. Naklonovali jsme, exprimovali a charakterisovali rekombinantní lidskou a myší serinovou racemasu, vyvinuli test její aktivity, identifikovali nové substráty a inhibitory tohoto enzymu a v současné době pracujeme na studiu jeho strukturu a aktivity.

[relevantní publikace: Stříšovský et al. (2005), Stříšovský et al. (2003)].