Významné výsledky 2015

 

1. Fyziologie vazopresinové a oxytocinové signalizace v neuronech supraoptického jádra hypotalamu.

Magnocelulární vazopresinové (AVP) a oxytocinové (OT) neurony supraoptického jádra hypotalamu jsou charakteristické specifickými elektrofyziologickými vlastnostmi, syntetizují hormony AVP a OT a vylučují je na základě různých fyziologických stimulů. Elektrická aktivita je regulována autokrinní sekrecí hormonů buď autokrinní z dendritů anebo in vitro, aplikací hormonů v řezech. K tomu dochází prostřednictvím specifických OT a AVP auto-receptorů, které aktivují Ca2+ signální dráhy a tím regulují buněčné procesy (viz ref. 1, 2, 3, 5, 7, 9, 15). V nedávné době jsme prokázali existenci spontánních Ca2+ oscilacích v obou typech OT a AVP neuronů čerstvě izolovaných ze supraoptického jádra. Oscilace probíhají synchronně jak v jádře, tak v dendritech neuronů (viz video-1), na rozdíl od signálů vyvolaných draslíkovou depolarizací, kdy se Ca2+ signál šíří od dendritu směrem k tělu neuronu (viz video-2). K analýze Ca2+ dynamiky jsme vyvinuli výpočetní metodu schopnou odhadnout toky Ca2+ přes membránu neuronů a ve studiu spontánních oscilací se nám podařilo identifikovat základní mechanismy buněčné membrány, jež se na oscilacích podílí. K dosažení výsledků využíváme techniku rychlé fluorescenční fotometrie, umožňující sledovat vnitrobuněčnou koncentraci v reálném čase ve vysokém časovém i prostorovém rozlišení. Měřené neurony vystavujeme působení různých látek s cílem specificky ovlivnit konkrétní mechanismus buněčné dynamiky, využíváme například specifické inhibitory Ca2+ kanálů, endoplazmatického retikula, Ca2+ pump nebo vnitrobuněčných Ca2+ signálních drah.

 

Schéma Ca2+ transportních mechanismů. Červeně jsou zvýrazněny ty mechanismy, které byly identifikovány jako základní mechanismy spontánních Ca2+ oscilací..

 

 

2. Fyziologie vazopresinu, oxytocinu a Ca2+ signalizace buňkách dorsálních gangliích periferního nervového systému

Kromě důležité role vazopresinu a oxytocinu v centrálním nervovém systému bylo v nedávné době odhaleno, že oba hormony hrají důležitou roli v periferním nervovém systému. Konkrétně AVP může být důležitý při regulaci nocicepce a pro OT bylo ukázáno, že má silné analgetické schopnosti. V našem oddělení si klademe za cíl prostudovat roli AVP a OT v dorsálních gangliích isolovaných z transgenních potkanů s fluorescenčním značením pro AVP a OT (AVP-eGFP, OT-mRFP a dvojitě transgenní model AVP-eGFP, OT-mRFP). Již jsme ukázali, že v těchto potkanech jsou OT a AVP exprimované a mohou být přímo vizualizované v čerstvě izolovaných dorsálních gangliích a v kultivovaných neuronech. Tato exprese ji zvýšena během gravidity a laktace. Měřením vnitrobuněčné koncentrace Ca2+ jsme odhalili, že neurony dorsálních ganglií citlivých na kapsaicin také exprimují funkční AVP a OT receptor, což indikuje doposud neznámý fyziologický efekt těchto neurohormonů v vnímání bolesti spojené s graviditou a možné fyziologickou roli OT během laktace.

Oba hormony AVP i OT jsou exprimovány v dorsálních gangliích a v neurohypofýze čerstvě izolovaných z transgenních potkanů a mohou být vizualizovány v transgenních potkanech. Neurohypofýza (horní řada) a dorsální ganglia (spodní řada) byly izolovány ze stejného transgenního potkana a zobrazeny s pomocí konfokálního mikroskopu. Levý panel: AVP-eGFP; prostřední panel: AVP-eGFP/OT-mRFP a pravý panel: OT-mRFP. Indikátor měřítka obrázku odpovídá 50 µm.

 

3. Vápníková signalizace v kmenových buňkách
Kmenové buňky různého původu přinesly naději díky svému potenciálu pro využití v buněčné terapii. Ca2+ signální dráhy mají klíčovou roli v diferenciaci kmenových buněk a jejich proliferaci. Porucha regulace Ca2+ homeostázy může být příčinou závažných patologií, přičemž v současné době není plně porozuměno roli vápníkových kanálů a receptorů v kmenových buňkách. V posledních letech jsme objevili: (i) pre-diferenciace lidských embryonálních kmenových buněk (hESCs) vede k aktivaci Ca2+ signálních kaskád a posílení funkční aktivity těchto buněk (ref. 9, 12); (ii) homeostáza Ca2+ a fyziologické vlastnosti neurálních prekurzorů (NP) derivovaných z hESCs se významně mění během dlouhodobého procesu diferenciace in vitro (viz ref. 9, 12); (iii) diferenciace NP derivovaných z lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk ovlivňuje expresi iontových kanálů a receptorů (viz ref. 10, 12); (iv) tyto NP vykazují spontánní aktivitu indikující, že jejich elektrofyziologické vlastnosti a vlastnosti a Ca2+ homeostázy jsou podobné těm u dospělých neuronů (viz ref. 10, 12, 17, 18); (v) exprese iontových kanálů a receptorů v mesenchymálních kmenových buňkách isolovaných z tukové tkáně a kostní dřeně potkanů nezávisí pouze na podmínkách diferenciace, ale také na původu těchto buněk. To naznačuje, že osud a funkční vlastnosti diferenciovaných buněk jsou silně řízeny vnitřními mechanismy buněk. Závěrem lze konstatovat, že identifikace a přiřazení konkrétních typů iontových kanálů a jedinečných vlastností Ca2+ homeostázy ke konkrétním typům buněk bude nezbytné k posouzení jejich kvalifikace pro lékařský výzkum a potenciální aplikaci v buněčné terapii (viz ref. 17, 18, 19).

 

Schéma funkční exprese Ca2+ kanálů a receptorů podílejících se na Ca2+ signalizaci v kmenových buňkách derivovaných z tukové tkáně (ADSCs) a v kmenových buňkách derivovaných z kostní dřeně (BMSCs) během pre-diferenciace (pro bližší detaily viz ref. 17, 18, 19).

 

1. Periferní chimérismus kmenových buněk derivovaných z kostní dřeně po transplantaci: regenerace gastrointenstinální tkáně u letálně ozářených myší

V naší studii jsme otestovali model využívající celotělového ozáření a transplantace kostní dřeně nebo hematopoetických kmenových buněk (HSC) pro vyšetření obnovy krvetvorby, extramedulární krvetvorby a migrace buněk exprimujících zelený fluorescenční protein (GFP) transplantovaných do ne-hematopoetických tkání. Naše výsledky demonstrují, že celotělové ozáření nemění signifikantně integritu takových tkání, jako jsou ty v tenkém střevu a v játrech. Celotělové ozáření také vyvolalo myeloablaci a chimérismus v tkáních a vstup transplantovaných buněk do malého střeva a jater. Buňky štěpů kostní dřeně nebo buňky GFP+lin-Sca-1+ nejsou přechodně v gastrointenstinálním traktu a proto by mohli být využity k dlouhodobé léčbě řady patologií.

Histologické analýzy buněčného transplantátu v tenkém střevu. Měřítko: (A–D) 100 μm, (E) 25 μm, (F) 20 μm.

Spolupráce: Prof. MUDr. Stanislav Filip, LF UK V Hradci Králové

Publikace: 

Filip S, Mokrý J, Vávrová J, Sinkorová Z, Mičuda S, Sponer P, Filipová A, Hrebíková H, Dayanithi G,J (2014): The peripheral chimerism of bone marrow-derived stem cells after transplantation: regeneration of gastrointestinal tissues in lethally irradiated mice, Cell Mol Med. May;18(5):832-43. IF 3.698

1. Plasticita vápníkových signalizačních kaskád v embryonálních prekurzorech pocházejících z lidských kmenových buněk.

2. Podmíněně imortalizované kmenové buněčné linie pocházející z lidské míchy udržují regionální identitu a generují funkční V2A interneurony a motorneurony.

Tyto studie popisují mechanizmy zapojené do vápníkové homeostázy v průběhu diferenciace kmenovych buněk. Neurální prekurzory (NPs) pocházející z lidských embryonálních a fetalních kmenových buněk jsou považovány za slibný nástroj pro buněčnou terapii poraněné nervové tkáně a neurodegenerativních onemocnění CNS, a analýza jejich funkčních vlastností zůstáva stále otevřenou. Naším cílem bylo studium fyziologie a role vápníku a jeho signálních mechanizmů pro pochopení funkčních vlastností neurálních prekurzorů pocházejících z lidských kmenových buněk v průběhu jejich diferenciace. Naše výsledky ukazují, že tyto buňky reagují na různé fyziologické stimuly zvýšením [Ca2+]i, která se mění v průběhu diferenciace. Buňky exprimují funkční glutamátové a purinergní receptory, napětˇově závislé vápníkové kanály a ukazují spontánní Ca2+ oscilace, jak je obvykle pozorováno v neuronech. Znalost funkčních vlastností kmenových buněk nám umožní lépe kontrolovat jejich regenerační potenciál a dále i pomohou zlepšit strategie pro jejich použití při transplantacích a léčbě.

Spolupráce:

• The James Black Centre, Department of Neuroscience, King’s College London, UK
• University of Manchester, School of Biological Sciences, Manchester, UK
• Department of Physiology, School of Medicine, Birmingham University, Birmingham, UK
• Department of Veterinary Physiology, Faculty of Agriculture, Tottori University, Tottori, Japan
• Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité de recherche U710, Université Montpellier 2, Montpellier; and Ecole Pratique des Hautes Etudes, Sorbonne, France

Intracelulární Ca2+ zásoby (ryanodinové) a spontánní [Ca2+]i oscilace pozorované v 7 pasáži neurálních prekurzorů pocházejících z lidských embryonálních kmenových buněk.

leden 2017 – prosinec 2022
Poskytovatel: Evropská unie/ Česká republika - Strukturální fondy
Číslo: CZ.02.1.01/0.0/15_003/0000419
Role: člen týmu
Název: Center of Reconstructive Neuroscience

leden 2017 – prosinec 2019
Poskytovatel: Grantová agentura České republiky
Číslo: GA CR P303/17-21146S
Role: Principal Investigator
Název: Induction of human mesenchymal stromal cells to secrete neural growth factors for the purpose of spinal cord regeneration after the injury

leden 2015 – prosinec 2017
Poskytovatel: Grantová agentura České republiky
Číslo: GA CR P304/15/09161S
Role: Project participant
Název: Muscle remodelling on the basis of extracellular matrix seeded with functionally characterized stem cells

2016

Dayanithi, G., Verkhratsky, A.: (2016) Calcium signalling in stem cells: Molecular physiology and multiple roles. Cell Calcium., 59(2-3):55-6.

Forostyak, O., Forostyak, S., Kortus, Š., Syková, E., Verkhratsky, A., Dayanithi, G.: (2016) Physiology of Ca(2+) signalling in stem cells of different origins and differentiation stages. Cell Calcium, 59(2-3):57-66.

Forostyak, O., Butenko, O., Anděrová, M., Forostyak, S., Syková, E., Verkhratsky, A., Dayanithi, G.: (2016) Specific profiles of ion channels and ionotropic receptors define adipose- and bone marrow derived stromal cells. Stem Cell Res., 16(3):622-634.

Kortus, Š., Srinivasan, C., Forostyak, O., Ueta, Y., Syková, E., Chvátal, A., Zápotocký, M., Verkhratský, A., Dayanithi, G.: (2016) Physiology of spontaneous [Ca2+]i oscillations in the isolated vasopressin and oxytocin neurones of the rat supraoptic nucleus. Cell Calcium, 59(6):280-8.

Kortus, Š., Srinivasan, C., Forostyak, O., Zápotocký, M., Ueta, Y., Syková, E., Chvátal, A., Verkhratský, A., Dayanithi, G.: (2016) Sodium-calcium exchanger and R-type Ca2+ channels mediate spontaneous [Ca2+]i oscillations in magnocellular neurones of the rat supraoptic nucleus. Cell Calcium, 59(6):289-98.

Skoloudik, L., Chrobok, V., Kalfert, D., Koci, Z., Sykova, E., Chumak, T., Popelar, J., Syka, J., Laco, J., Dedková, J., Dayanithi, G., Filip, S.: (2016) Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells in the Treatment of Postoperative Temporal Bone Defect: An Animal Model. Cell Transplant., 25(7):1405-14.

Forostyak, O., Dayanithi, G., Forostyak, S.: (2016) CNS Regenerative Medicine and Stem Cells. Opera Med Physiol., 2(1):55-62.
Dayanithi, G., Kortus, S., Forostyak, O., Sykova, E., Verkhratsky, A.: (2016) Calcium Oscillations in the Isolated Vasopressin Neurons of the Rat Supraoptic Nucleus. Endocrine Reviews, 37(2), Supplement.

Forostyak, O., Dayanithi, G., Forostyak, S., Sykova, E.: (2016) Oxytocin and Vasopressin-Induced Calcium Signals in Rat Adipose and Bone Marrow Derived Stem Cells. Endocrine Reviews, 37(2), Supplement.

2015

Forostyak, O., Romanyuk, N., Verkhratsky, A., Syková, E., Dayanithi G.: (2015) Plasticity of calcium signaling cascades in human embryonic stem cell-derived neural precursors. Stem Cells Dev. 22(10):1506-1521.

Školoudik, L., Chrobok, V., Kalfert, D., Koči, Z., Syková, E., Chumak, T., Popelář, J., Syka. J., Laco, J., Dedková, J., Dayanithi, G., Filip, S.:(2015) Human multipotent mesenchymal stromal cells in the treatment of postoperative temporal bone defect: an animal model. Cell Transplant. 25(7):1405-1414.

Moriya, T., Shibasaki, R., Kayano, T., Takebuchi, N., Ichimura, M., Kitamura, N., Asano, A., Hosaka, YZ., Forostyak, O., Verkhratsky, A., Dayanithi, G., Shibuya, I., (2015) Full-length transient receptor potential vanilloid 1 channels mediate calcium signals and possibly contribute to osmoreception in vasopressin neurones in the rat supraoptic nucleus. Cell Calcium. 57(1): 25-37.

Filipová, A., Diaz-Garcia, D., Bezrouk, A., Čížková, D., Havelek, R., Vávrov,á J., Dayanithi, G., Řezacová, M.: (2015) Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biol. Int. 39(8): 943-953.
Kortus, S., Dayanithi, G., Zapotocky, M.: (2015). Computational estimation of calcium fluxes in isolated magnocellular neurons. BMC Neuroscience 16: (suppl 1) P299.

2014

Filip, S., Mokrý, J., Vávrová, J,, Sinkorová, Z., Mičuda, S., Sponer, P., Filipová, A., Hrebíková, H., Dayanithi. G,: (2014). The peripheral chimerism of bone marrow-derived stem cells after transplantation: regeneration of gastrointestinal tissues in lethally irradiated mice. J Cell. Mol. Med 18: 832-843.

Viero, C., Forostyak, O., Sykova, E., Dayanithi, G.: (2014). Getting it right before transplantation: example of a stem cell model with regenerative potential for the CNS. Front. Cell Dev. Biol 2:36. doi: 10.3389/fcell.2014.00036.

2013

Forostyak O, Kozubenkoa N, Verkhratsky A, Sykova E & Dayanithi G (2013). Plasticity of calcium signaling cascades in human embryonic stem cell-derived neural precursors. Stem Cells and Development 22: 1506-1521.

Cocks G, Romanyuk N, Amemori T, Forostyak O, Dayanithi G, Jendelova P, Jeffries A, Thuret S, Miljan E, Sinden J, Sykova E & Price J (2013). Conditionally immortalised stem cell lines from human spinal cord retain regional identity and generate V2a interneurons and motorneurons. Stem Cell Research and Therapy 4: article 69.

Filip S, Mokrý J, Vávrová J, Sinkorová Z, Mičuda S, Sponer P, Filipová A, Hrebíková H & Dayanithi G (2014). The peripheral chimerism of bone marrow-derived stem cells after transplantation: regeneration of gastrointestinal tissues in lethally irradiated mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine 18: 832-843.

Calcium imaging high K induced calcium response in vasopressin neurone 

Calcium oscillations in GFP transgenic neuron 

Prof. Izumi Shibuya, Laboratory of Veterinary Physiology, Joint Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Tottori University, Tottori, Japan

Prof. Yoichi Ueta, Department of Physiology, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu, Japan

Prof. Alexei Verkhratsky, University of Manchester, School of Biological Sciences, Manchester, UK

Prof. Jose R. Lemos, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA.

Prof. Jean-Michel Verdier, INSERM U 1198, University of Montpellier , France;

École Pratique des Hautes Études-Sorbonne, Paris, France