DNA ozdobená aldehydy pro připojení dalších molekul

Byla vyvinuta nová metodika připojování různých molekul k DNA (tzv. biokonjugace). Tato metoda spočívá v syntéze DNA nesoucí velmi reaktivní aldehydové skupiny, na které lze snadno v jednom kroku připojit jiné molekuly např. pro studium molekulárního mechanismu biologických procesů nebo pro značení DNA barevnými nebo elektroaktivními značkami. Klíčovým meziproduktem je DNA nesoucí velmi reaktivní aldehydové skupiny jako molekulární "věšáčky". Metoda její přípravy se skládá ze dvou stupňů. Prvním krokem je příprava modifikovaného nukleosid trifosfátu a druhým enzymatická výstavba DNA z těchto stavebních bloků katalyzovaná DNA polymerasou. Metoda by mohla najít uplatnění při přípravě biokonjugátů DNA, v materiálovém výzkumu a nanotechnologiích.

Klíčovým meziproduktem je DNA nesoucí velmi reaktivní aldehydové skupiny jako molekulární "věšáčky". Metoda její přípravy je velmi rychlá a skládá se z pouhých dvou stupňů. Prvním krokem je příprava modifikovaného nukleosid trifosfátu a druhým enzymatická výstavba DNA z těchto stavebních bloků katalyzovaná DNA polymerasou. Tímto způsobem lze připravit jak krátké sekvence DNA obsahující jen jednu nebo několik málo "věšáčků", tak i dlouhé DNA o tisících nukleotidů obsahující stovky těchto reaktivních skupin. Aldehydové skupiny ochotně reagují s celou řadou látek, a lze na ně tedy navázat prakticky jakoukoli další molekulu. Tento princip byl prokázán např. tvorbou barevných sloučenin (hydrazonů), pomocí kterých byla DNA obarvena na žlutou nebo růžovou barvu (viz obrázek). Nyní jsou studovány další reakce takto modifikované DNA pro připojování důležitých biomolekul (peptidů, proteinů apod.). Tato metoda by mohla najít široké uplatnění nejen při snadné přípravě nejrůznějších typů biokonjugátů DNA, ale i např. v materiálovém výzkumu a nanotechnologiích, kde DNA může sloužit jako snadno programovatelné a obnovitelné "lešení" pro připojení užitečných chemických molekul a funkčních skupin.

Raindlová V., Pohl R., Šanda M., Hocek M.:
Direct polymerase synthesis of reactive aldehyde-functionalized DNA and its conjugation and staining with hydrazines.
Angewandte Chemie International Edition 49: 1064-1066 (2010).

Modifikované insuliny pomáhají lépe pochopit mechanismus účinku hormonu

Insulin je jedním z nejdůležitějších hormonů organismu. Ztráta schopnosti produkce insulinu či neschopnost organismu insulin využít vede k onemocnění zvanému diabetes mellitus. Odhaduje se, že v roce 2009 dosáhl ve světě počet diabetiků již 245 miliónů. Působení insulinu je zprostředkováno jeho vazbou na specifický membránový receptor. Přes desítky let intenzivního výzkumu stále nebyla vyřešena struktura komplexu insulinu s receptorem. Je nicméně zřejmé, že známé 3-D struktury insulinu představují pouze zásobní a neaktivní formy hormonu. Předpokládá se, že molekula insulinu musí při interakci s receptorem podléhat rozsáhlým strukturním změnám vedoucím k vytvoření tzv. aktivní formy insulinu. Naší skupině se podařilo připravit sérii vysoce aktivních analogů insulinu modifikovaných v pozici B26. Strukturní analýza pomocí rentgenové krystalografie vyjevila, že tyto analogy mají unikátní struktury u β-ohybu C-konce B-řetězce ("B26 turn" na obrázku vlevo) doprovázený trans-cis izomerií peptidové vazby B25-B26 (detail na obrázku vpravo). Tento ohyb má za důsledek odkrytí jiné části insulinu nezbytné pro vazbu na receptor. Oprávněně se domníváme, že struktury těchto analogů mohou být velmi podobné aktivní formě insulinu. Naše výsledky představují průlom ve studiu interakce insulinu s receptorem. Modifikované insuliny napodobující aktivní formu hormonu mohou být výchozím bodem pro přípravu dalších analogů insulinu či jeho mimetik, které by mohly najít uplatnění při nasální, pulmonální či orální aplikaci při léčení diabetu.

Jiráček J., Ţáková L., Antolíková E., Watson C.J., Turkenburg J.P., Dodson G.G., Brzozowski A.M.:
Implications for the active form of human insulin based on the structural convergence of highly active hormone analogues.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 1966-1970 (2010).

Strukturní motivy Gag polyproteinů důležité pro skládání retrovirových částic

Skládání nové virové částice v hostitelských buňkách představuje důležitý krok v životním cyklu retrovirů. Nově syntetizované prekursory virových proteinů (tzv. Gag polyproteinů) jsou v buňce transportovány k místu skládání, kde společně s virovou RNA začínají tvořit nezralou virovou částici. Detailní znalost strukturních motivů Gag polyproteinů, které hrají klíčovou roli v procesu skládání, je důležitá jak pro pochopení tohoto komplexního procesu, tak pro vývoj specifických inhibitorů, které blokují buď vzájemné interakce virových strukturních proteinů, nebo interakce proteinů s virovou RNA. Při studiu skládání částic opičího Mason Pfizerova viru (Mason-Pfizer monkey virus, M-PMV) a viru myšího tumoru prsní žlázy (Mouse mammary tumor virus, MMTV) se nám podařilo pomocí in vitro i in vivo experimentů a analýz divokého typu virů a série jejich mutantů identifikovat strukturní motivy Gag polyproteinů, které jsou kritické pro tvorbu nezralých retrovirových částic. Tyto domény nebyly doposud popsány a přinášejí důležité poznatky pro pochopení procesu skládání. Pro testování inhibitorů skládání jsme vyvinuli unikátní metodu, založenou na měření inhibice interakce virového strukturního proteinu se značeným oligonukleotidem, která je použitelná pro testování ve velkém měřítku. Metoda byla patentována.

Rumlová M., Ruml T., Hadravová R., Pichová I.:
Method of testing of inhibitors of assembly using labeled oligonucleotides or nucleic acids.
PV 2010-718