Laserový skenovací konfokální mikroskop se superkontinuálním “bílým” laserem a dvoufotonovou excitací Leica SP8 WLL MP

 

Mikroskop: invertovaný mikroskop Leica DMi8 s binokulárním nástavcem, motorizovaným kondensorem a bočním portem pro připojení kamery na snímání preparátů v procházejícím světle, DIC a fluorescenci; motorizovaný skenovací stolek (rozsah posuvu 127 x 83mm, možnost snímání ROI, TileScan, Mark&Find) s vložkou Super Z Galvo (rozsah z-posuvu 1500 µm).

 

Základní sada objektivů:

    1. HC PL FLUOTAR (FLUOR) 5x/0.15 NA, WD=10 mm;

    2. HC PL FLUOTAR (FLUOR) 10x/0.30 NA, WD= 11 mm;

    3. multiimerzní objektiv HC PL APO 20x/0.75 NA, IMM CORR CS2, WD=0.67 mm, DIC;

    4. HC PL APO 63x/1.20 NA W CORR CS2, WD=0.30 mm, DIC;

    5. HC PL APO 63x/1.40 NA OIL CS2, WD=0.14 mm, DIC.

(po dohodě lze použít i objektivy užívané na jiných mikroskopech firmy Leica Microsystems)

 

Konfokální hlava UV-VIS-IR: akusticko-optický dělič paprsků (AOBS), konvenční skener (7 fps @ 512x512 při jednosměrném snímání) a rychlý rezonanční skener (14 fps @ 512x512), spektrální detektor s laditelným emisním rozsahem 350 nm - 800 nm.

 

Lasery:

1. DMOD 405nm (50 mW),

2. Ar laser s 5 excitačními vlnovými délkami 458 - 476 - 488 - 496 - 514 nm (65 mW),

3. Pulsní superkontinuální “bílý” laser druhé generace WLL2 s rozsahem excitačních vlnových délek 470 – 670 nm (výkon laseru při každé vlnové délce cca. 1,5 mW) s možností využití až 8 vlnových délek současně pomocí AOBS (nastavitelné v krocích 1 nm) s nezávislým ovládáním výkonu každé vlnové délky pro rychlou modulaci intenzity laseru pomocí 8-kanálového akusticko-optického laditelného filtru (AOTF);

4. Pulsní infračervený laditelný laser Chameleon Ultra I (Coherent Inc., CA) s rozsahem vlnových délek 690 – 1040 nm, maximálním výstupním výkonem 4 W, pulsní frekvencí 80 MHz, šířkou pulsu ~140 fs a s ovládáním intensity laseru pomocí elektrooptického modulátoru (EOM) a atenuátoru.

 

Detektory:

1. Interní (konfokální) – 4 detektory:

a) Dva HyD spektrální detektory, t.j. vysoce citlivé hybridní detektory s maximální kvantovou účinností 45% (při 500 nm), s rozsahem detekce 400 – 720 nm, s nízkým šumem a velkým dynamickým rozsahem, s možností photon counting módu a gaitingu, možností nastavovat gain pro každý detektor zvlášť, možností vybrat libovolné spektrum pro detekci a libovolné detekční okno; šířka okna od 1 nm;

b) Dva PMT interní detektory s vysokou citlivostí, QE = 30% (při 500 nm), s rozsahem detekce 400 - 800 nm, s  možností nastavovat offset a gain pro každý detektor zvlášť, s možností vybrat libovolné spektrum pro detekci a libovolné detekční okno  - šířka okna od 1 nm;

2. Externí (non-descanned) – 3 detektory:

a) Dva vysoce citlivé HyD spektrální detektory (s rozsahem 400 – 720 nm) s nízkým šumem a s vysokým dynamickým rozsahem, s možností photon counting módu a gaitingu;

b) TLD – PMT detektor pro snímání v procházejícím světle (BF) nebo DIC, použitelný současně s dalšími kanály (konfokálními a externími).

 

Komůrka pro snímání živých buněk:

Systém od firmy Oko-Lab s kontrolou teploty H301-T-UNIT-BL-PLUS (včetně ohřívače objektivů), koncentrace CO2 (0-20%) a O2 (1-95%, hyperoxické podmínky pouze v případě domluvy se správcem ohledně zajištění dodání O2 do inkubátoru) CO2-O2 Unit-BL [0-20;1-95], zavlhčovací jednotkou a komůrkou H301-K-FRAME s možností perfúze, vložkou GS35-M (pro  1 podložní sklo s rozměry 1x 25x76 mm a až 2 Petriho misky se skleněným dnema s průměrem 35 mm) a s magnetickými držáky vzorků.

 

FLIM modul:

jednokanálový TCSPC systém pro snímání časově korelovaných jednotlivých fotonů v jednom spektrálním kanálu Simple-Tau-150-D1 (Becker & Hickl GmbH, Berlin, Německo). Ultrarychlý systém pro registraci jednotlivých fotonů na bázi SPC-150 modulu se skládá z PCI-boxu, ovladače detektoru DCC-100 a chlazeného velmi rychlého detektoru PMC-100-1 na bázi fotonásobiče (s rozsahem detekcí 300 – 820 nm) a kontrolního notebooku. Pro snímání FLIM dat lze použít i standardní externí hybridní detektory Leica HyD NDDs (2x), umístěné na bočním portu invertovaného mikroskopu Leica DMi8. Dále je možné současné snímání FLIM a PLIM dat ve 2 kanálech pomocí speciálních SPC desek (laskavě zapůjčených od firmy Becker & Hickl GmbH).

Software: LAS X pro ovládání stativu mikroskopu, automatizované snímání obrazů a sérií obrazů (z-série, časosběrné série, spektrální λ-série a jejich kombinace) s použitím různých laserů včetně sekvenčního snímání.

SW moduly: Dye Finder, Live Data Mode, 3D Visualisation, Co-Localisation, MicroLab (pro FRAP, FRET, FLIP experimenty i ROI), FRAP Zoomer (pro FRAP na tandemovém skeneru).