Indukované pluripotentní buňky (iPSC) jsou nespecializované (nediferencované) buňky, které jsou schopny neomezeného dělení (sebeobnovy). Za pomocí specifických transkripčních faktorů (Oct4, Sox2, Klf4 a c-Myc; Nanog a Lin28), které jsou vnesené do buňky, se jakákoli somatická (plně diferencovaná) buňka z dospělého těla savců může reprogramovat (přeměnit) na buňku indukovanou pluripotentní. Díky této reprogramaci jsou iPSC molekulárně i funkčně velmi podobné embryonálním kmenovým buňkám (ESC). Stejně jako ESC mají schopnost sebeobnovy a schopnost dát vznik všem třem zárodečným vrstvám, ektodermu, mezodermu a endodermu. Tím by odpadla kontroverzní otázka využití lidských embryí pro tvorbu kmenových buněk. iPSC mohou po přidání specifických faktorů do kultivačního média vytvářet (diferencovat) všechny typy buněk, kterých je u člověka něco kolem 200. Velkou výhodou v praktickém využití iPSC je snadná dostupnost buněk pro reprogramaci, které lze izolovat přímo z krve nebo kůže pacienta. Vytvoření iPSC buněk „na míru“ pro každého pacienta umožní autologní transplantaci (transplantaci vlastních buněk) a odpadnou tak problémy s hledáním vhodného dárce se shodnými imunologickými parametry. S ohledem na tyto vlastnosti by iPSC mohly mít v budoucnu významné zastoupení v regenerativní medicíně jako náhrada buněk a tkání.
Použitá a citovaná literatura:
Uvedena v samostatném souboru níže pod obrazovou galerií
Induced pluripotent stem cells (iPSC) are unspecialized (undifferentiated) cells, which are capable of unlimited self-renewal. By introducing specific transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc; Nanog and Lin28), any somatic (fully differentiated) cell of the mammalian body can be changed (reprogrammed) into an induced pluripotent stem cell. The reprogrammed iPSCs are very similar to embryonic stem cells (ESCs) in their molecular and functional properties. They have the same ability to self-renew and can give rise to all three germ layers – ectoderm, mesoderm and endoderm. This would avoid the controversial use of human embryos for the creation of ESCs. There are approximately 200 cell types in the human body. By adding specific factors into a culture medium, iPSCs can be differentiated into each of them. The big advantage of iPSCs is the availability of somatic cells for reprogramming, which could be easily isolated from blood or skin biopsy. Creation of “tailor made” iPSCs for each patient would allow autologous transplantation (transplantation of own cells) and avoid problems with finding an immunologically compatible donor. All this means the iPSCs could be used in regenerative medicine as a cell and tissue replacement.
-
Vývojový potenciál buněk. Totipotence (A) znamená schopnost vytvořit všechny buněčné typy organismu, ale také extraembryonální tkáně – např. embryonálních obalů nebo části placenty. U savců je totipotentní pouze zygota (oplozené vajíčko) a blastomery během několika prvních buněčných dělení. Pluripotencí (B) nazýváme schopnost diferencovat v buňky všech tří zárodečných vrstev (ektodermu, mezodermu a endodermu). Ve stadiu blastocysty již embryo není totipotentní, ale ve vnitřní mase buněk (ICM, Inner Cell Mass; značené oranžově) se nacházejí pluripotentní buňky, z nichž později vzniknou všechny tkáně vlastního embrya. Z buněk ICM byly kultivací in vitro odvozeny embryonální kmenové buňky (ESC, Embryonic Stem Cells). Z epiblastu, specifické části embrya po implantaci (modře značené) byly podobně odvozeny pluripotentní epiblastové kmenové buňky (EpiSC, Epiblast Stem Cells). Příklad multipotence a unipotence (C). Z multipotentní hematopoetické kmenové buňky během procesu krvetvorby (hematopoézy) vznikají dvě linie, myeloidní a lymfoidní. Z myeloidních a lymfoidních kmenových buněk jsou dále odvozeny prekurzorové buňky, z těch vznikají pouze diferencovanější buňky, další prekurzory nebo terminálně diferencované buňky. Prekurzorové buňky mohou být multipotentní a unipotentní. Multipotentní buňky přispívají k několika typům terminálně diferencovaných buněk. Jde o myeloblast – multipotentní prekurzor, z něhož vycházejí různé druhy bílých krvinek – monocyty, neutrofilní, bazofilní a eozinofilní granulocyty, a lymfoblast, jako prekurzor T a B lymfocytů. Unipotentní prekurzory vytvářejí vždy pouze jeden buněčný typ – proerytroblast je předchůdcem červených krvinek (erytrocytů) a megakaryoblast krevních destiček (trombocytů). Orig. K. Vodičková Kepková
-
Reprogramování buněk. Metoda jaderného přenosu (A) – z oocytu ve stadiu metafáze II (M II) jsou odstraněny metafázní chromozomy (proces enukleace) a naopak vneseno jádro z terminálně diferencované buňky (unipotentní). Vzniklé embryo můžeme nechat dále vyvíjet in vitro do stadia blastocysty a z její ICM kultivovat NT-ESC (NT – Nuclear Transfer; embryonální kmenové buňky po jaderném přenosu). Také lze přenést vzniklé embryo do dělohy náhradní matky a nechat narodit klon. Při buněčné fúzi (B) po spojení somatických buněk s buňkami embryonálními vznikne pluripotentní hybridní linie. Indukované reprogramování (C) znamená, že somatická buňka je reprogramována pomocí vnesení transkripčních faktorů (TF) za vzniku indukovaných pluripotentních buněk (iPSC). Orig. K. Vodičková Kepková
-
Kolonie iPSC se vyznačují přítomností enzymu alkalická fosfatáza a barví se červeně. Diferencované buňky, z nichž jsou iPSC odvozeny, tento enzym neexprimují a zůstávají bez zabarvení. Foto P. Vodička
-
Kolonie prasečích iPSC odvozených reprogramováním transkripčními faktory Oct4 (exprese zeleně), Klf4 a c-Myc (viz tab. 1). Foto P. Vodička
-
Tvorba indukovaných pluripotentních buněk. K reprogramování somatických buněk (A) se používají specifické transkripční faktory Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog a Lin28 (OSKMNL – tab. 1) a malé nekódující RNA (microRNA – miRNA) důležité pro epigenetickou regulaci buněčného genomu (blíže v textu). Geny pro transkripční faktory a miRNA mohou být doručeny do buněk několika způsoby (B). Metody doručení dělíme na integrující a neintegrující do hostitelského genomu. Do první skupiny patří integrující virové vektory a metody, které geny vkládají, ale následně je lze z genomu vystřihnout. Do metod neintegrujících náležejí viry a vektory, které se nepotřebují začlenit do hostitelského genomu, a reprogramování s využitím mediátorové RNA (mRNA) a proteinů. Somatické buňky lze snadno získat z krevního vzorku nebo biopsií kůže (C). Fibroblasty z biopsií kůže jsou epigeneticky reprogramovány TF a miRNA. Reprogramování můžeme podpořit přidáním malých molekul (např. vitamínem C nebo inhibitorem GSK3-beta kinázy) do kultivačního média. Celý proces trvá přibližně dva týdny a vznikají iPSC se schopností přispívat do všech zárodečných tkání (ektoderm, mezoderm a endoderm) a jsou tedy pluripotentní stejně jako embryonální kmenové buňky. Orig. K. Vodičková Kepková