Analýza komplexních směsí lipidů

Lipidy tvoří velmi důležitou součást buněčných organismů. Mají mnoho funkcí, např. slouží pro ukládání energie, mají signální funkce, jsou součástí membrán a a slouží při ochraně povrchů těl živých organismů. Přírodní lipidy tvoří obvykle velice komplexní směsi. Jejich analýza není snadná a hraje nezanedbatelnou roli v lipidomice, která se zabývá komplexními vztahy lipidů v živých organismech. Naše skupina vyvíjí nové analytické metody charakterizace lipidů pomocí moderních separačních a MS technik. Vzorky jsou izolovány z různých organismů, zejména z hmyzu a rostlin.

Charakterizace triacylglycerolů v tukovém tělese hmyzu, konkrétně čmeláků, je jedním z našich projektů. Předchozí studie byly téměř výlučně zaměřeny na určování mastných kyselin pomocí transesterifikace a plynové chromatografie. Tímto postupem se však ztrácí důležité informace o vazbě mastných kyselin na glycerolovou kostru. Optimalizujeme vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii spojenou s hmotnostním spektrometrem s chemickou ionizací za atmosférického tlaku pro úplnou charakterizaci jednotlivých isomerů. K dosažení nejlepšího možného chromatografického rozlišení jsou používány dva systémy, bezvodá reversní fáze (RP-HPLC) a argentační chromatografie (katex se stříbrnými ionty). Jednotlivé složky jsou poté charakterizovány podle hmotnostního spektra. Interpretace spekter se provádí pomocí softwaru vyvinutého v naší skupině (viz dále).

Desorbce a ionizace laserem za účasti matrice (MALDI) se používá pro rychlou charakterizaci lipidových směsí. Hmotnostní spektra z MALDI neposkytují tolik informací jako HPLC/MS, ale získaná data jsou užitečná např. pro statistické vyhodnocení vzorku nebo pro chemotaxonomické účely. Jsou analyzovány různé třídy lipidů, včetně glycerollipidů, glykolipidů, voskových esterů, atd. Asi nejobtížněji se pomocí MALDI určují uhlovodíky. My je studujeme pro jejich zajímavé funkce u hmyzu a v rostlinné kutikule, kde se účastní různých interakcí mezi hmyzem a rostlinou. Uhlovodíky jsou většinou analyzovány pomocí GC/MS. Avšak GC i MS s elektronovou ionizací mají jistá omezení pro vysokomolekulární látky, takže lze detekovat pouze určitou část látek ze směsi. Analýza uhlovodíků pomocí MALDI je výhodná, protože je schopna pokrýt rozsah molekulových hmotností. Ovšem ionizace uhlovodíků pomocí MALDI není jednodůchá, neboť uhlovodíky postrádají polární skupinu náchylnou k protonaci nebo k vazbě s kationtem. My jsme ukázali, že uhlovodíky je možné ionizovat zachycením litného kationtu za použití matrice 2,5-dihydroxybenzoátu litného. Touto metodou byly charakterizovány uhlovodíky z kutikuky různých druhů hmyzu. Bylo objeveno také několik dosud neznámých uhlovodíků, avšak jejich struktura a biologické funkce budou teprve objasněny.

Analýza struktury proteinů a peptidů

Skupina hmotnostní spektrometrie se účastní mnoha projektů, kde je základem znalost struktury proteinů a peptidů.

Hmotnostní spektrometry se používají pro identifikaci biologicky aktivních peptidů, hlavně s antimikrobiálními účinky. Tandemová hmotnostní spektrometrie slouží pro sekvenování "de novo". V komplexních proteinových vzorcích jsou vyhledávány a identifikovány biomarkery závažných onemocnění. Mezi nejvíce používané nástroje patří hmotnostní mapování peptidů, peptidové sekvenování a vyhledávání v databázi. Ke studiu stupně exprese určitých proteinů se používají různé kvantifikační metody. Desorpce a ionizace laserem za účasti matrice slouží také k rychlé identifikaci bakteriálních kmenů a k vytvoření odpovídající databáze.