Routinní servisy

• dostupné relativně rychle
• bez omezení množství látek
• zajišťovány převážně technickými pracovníky podle standardních protokolů

ZODPOVĚDNÉ OSOBY:
Eva Tloušťová, ☎ 271 (cytotoxicitní testy, příjem vzorků, export dat)
Jana Günterová, ☎ 223 (flow cytometry)

• Testování cytotoxicity látek: Standardně testujeme v buněčných liniích CCRF-CEM, HL-60 (leukemické linie), HepG2 a Hela S3 (linie odvozené od solidních tumorů) kolorimetrickým XTT testem založeným na měření aktivity mitochondriálních dehydrogenáz respirujících (živých) buněk. V případech, kdy standardní metodu nelze použít (výrazně barevné, fluoreskující či jinak komplikované vzorky) máme v portfoliu i alternativní analytické metody jako je ATP test nebo laktátdehydrogenázový test. Disponujeme / jsme schopni zajistit také další buněčné linie. Detaily poskytneme individuálně na vyžádání.


• Analýza buněčného cyklu: Automaticky provádíme analýzu buněčného cyklu u všech látek, u kterých byla nalezena cytotoxická aktivita, a to při koncentraci IC₅₀ z testu cytotoxicity (po dohodě i jinak). Metoda je založená na cytometrické analýze množství DNA po značení propidiumjodidem. Zástava buněčného cyklu v jeho jednotlivých fázích (G1/0, S, G2, M) napoví mnohé o mechanismu účinku. Pomůže také vylepšit publikace zaměřené na protinádorové účinky látek.

Speciální servisy

• vhodné pro menší série látek (indikované případy)
• provedení obvykle v delším časovém horizontu dle momentální situace
• nutný vklad kvalifikovaných pracovníků

ZODPOVĚDNÉ OSOBY:
Helena Mertlíková Kaiserová, ☎ 114
Mirek Hájek, ☎ 393

Poznámka: U opakovaného využití servisů je možné se obracet přímo na odborné pracovníky, kteří tento servis prakticky provádějí

• Stanovení apoptózy: Apoptóza je proces programované buněčné smrti. Aktivace apoptózy je žádoucí u protinádorových látek. Klíčové je její odlišení od nekrózy, která je charakteristická autolýzou buňky s uvolněním buněčného obsahu do okolní tkáně, které tímto poškozuje. Námi používaná metoda duálního značení buněk fluorescenčně značeným annexinem V a propidiumjodidem umožňuje tyto dvě formy buněčné smrti odlišit. Kvantifikace značených buněk probíhá na průtokovém cytometru. Apoptózu alternativně stanovujeme i několika dalšími principiálně odlišnými metodami: stanovením aktivace kaspáz pomocí in situ fluorescenčního markeru nebo stanovením jejich aktivity v buněčném lyzátu, hodnocením fragmentace DNA (ELFO) či hodnocením mitochondriálního membránového potenciálu (FACS).


• Hodnocení (inhibice) syntézy RNA/DNA: Využíváme neradioaktivní imunocytochemickou metodu založenou na inkorporaci bromovaného prekurzoru nukleových kyselin tj. BrU a BrdU do nově syntetizovaného vlákna RNA resp. DNA živých buněk. Pomocí specifických protilátek jsou následně buňky označeny a syntéza nukleových kyselin kvantifikována průtokovým cytometrem.


• Detekce reaktivních kyslíkových forem (ROS) a markerů oxidačního stresu: Nabízíme jednoduchou cytometrickou metodu kvantifikující vliv látek na množství ROS v buňce. Metoda je založena na oxidaci ("rozsvícení") fluoresceinového derivátu CM-H₂DCF-DA uvnitř buňky. Sonda nereaguje na případné ROS přítomné v médiu, k její aktivaci je zapotřebí buněčných esteráz. Dále používáme specifičtější sondu MitoSOX pro stanovení produkce superoxidů v mitochondriích. Oxidační stres v buňkách jsme schopni prokázat stanovením glutathionu a produktů lipidové peroxidace ("TBARS assay").


• Stanovení intracelulárního Ca²⁺: Stanovení hladiny volného intracelulárního Ca²⁺ má mnohostranné využití. Ca²⁺ hraje důležitou úlohu v buněčné signalizaci, při uvolňování neurotransmiterů z neuronů, při kontrakcích všech typů svalových buněk (např. srdečních). Je také zásahovým místem mnoha toxinů. Používáme značení buněk fluorescenční sondou Fura-2, která je aktivována intracelulárně, kde po navázání vápníku vydává zelenou fluorescenci, kterou měříme na destičkovém readeru.


• Měření mitochondriálního membránového potenciálu (Ψ): Další jednoduchá cytometrická metoda, která může sloužit jako doplněk ke stanovení apoptosy nebo také ke zjišťování mitochondriální toxicity. Používáme fluorescenční sondu JC-1, která mění zabarvení v závislosti na mitochondriálním membránovém potenciálu z červené (respirující buňky) na zelenou (depolarizované buňky).


• Caco-2 permeační test: Metoda slouží k odhadu biologické dostupnosti při orálním podání léčiva. Využívá lidské nádorové střevní epiteliální buňky Caco-2, které jsou schopné vytvořit polarizovanou monovrstvu těsně přiléhajících buněk a mimikují tak střevní bariéru při absorpci léčiv. Prostup látek je možné hodnotit v obou směrech tj. z apikální na bazolaterální stranu monovrstvy (A-B) i naopak (B-A), čímž získáme navíc informaci o možném aktivním efluxu látky pomocí transportérů. Stanovení koncentrace látek na obou stranách monovrstvy provádíme pomocí HPLC, v některých případech pomocí MS (ve spolupráci se skupinou hmotnostní spektrometrie).


• Kinasové testy: Kinasy představují velmi důležitou skupinu enzymů, přenášející γ-fosfát z ATP na cílovou molekulu za vzniku ADP a fosforylovaného substrátu. V naší laboratoři používáme univerzální a citlivý luminiscenční kit založený na detekci vzniklého ADP. Teoreticky je jím možné detekovat jakoukoli dvojici substrát:kinasa. Momentálně jsme zavedeni na okamžité screenování inhibitorů lipidových kinas PI4KA a PI4KB. Po dohodě jsme schopni assay modifikovat pro případné další zájmové kinasy (limitující faktor: dostupnost/cena enzymu).
  Pozn.: Tento servis neslouží k hodnocení selektivity látek vůči celému panelu kinas tzv. kinasovému profilingu – nutno testovat komerčně!!


• Inhibice enzymů metabolismu purinů a pyrimidinů: Tradiční objekt zájmu naší skupiny. Z minulosti máme k dispozici řadu funkčních a citlivých metod (převážně radiometrických) pro detekci aktivity xanthinoxidasy, thymidinfosforylasy, adenosindeaminasy, adenosinkinasy, SAH-hydrolasy, purinnukleosidfosforylasy aj. (limitující faktor: dostupnost/cena enzymu a značeného substrátu).


• Inhibice NS5B polymerasy: Klíčový enzym replikace viru HCV. Aktivitu enzymu hodnotíme pomocí klasické polymerázové metody s využitím specifického RNA templátu a směsi nukleotidů. Detekce je založená na kvantifikaci inkorporovaného α-³³P-GTP pomocí phosphorimageru. Jde o nebuněčnou in vitro metodu tj. nutno dodat trifosfáty resp. jejich analogy.


• Izolace a kultivace buněčných primokultur: Pro některé specifické typy experimentů nejsou vhodné klasické "nesmrtelné" buněčné linie, ale je potřeba mít k dispozici buňky terminálně diferencované. V současnosti máme v laboratoři zavedenou techniku izolace potkaních embryonálních neuroblastů, které dále kultivujeme do podoby diferencovaných neuronů a využíváme je ke studiu neuroprotektiv. Máme zkušenosti i z oblasti izolace a kultivace některých dalších primokultur (kardiomyocyty, hepatocyty), které můžeme v případě zájmu oživit. Limitující faktor: dostupnost zvířat.


• Hodnocení mitochondriální toxicity: Pro látky, které prokázaly významnou biologickou aktivitu na cílové struktury, je vhodné časné stanovení případné mitochondriální toxicity (nejčastější důvod stažení látek z trhu nebo přerušení vývoje nových potenciálních léčiv). Standardní cytotoxicitní testy nejsou dostačující!! Nabízíme hodnocení mitochondriální toxicity pomocí Glu/Gal testu, který je založen na porovnání cytotoxicity v glukózovém a galaktózovém médiu. Nedostupnost glukózy v médiu vede ke změně buněčného metabolismu (glykolýza → oxidativní fosforylace) a zcitlivění buněk vůči mitochondriálním toxinům. Zejména pro nukleosidové analogy je pak vhodné stanovení vlivu látek na mtDNA a jí kódované proteiny.


• Duální luciferázový reporterový test: Nástroj pro sledování exprese genů a jejich regulace. Spočívá v transfekci dvou reportérů (experimentálního a kontrolního) do vhodné buněčné linie, přičemž exprese experimentálního reportéru je kontrolována studovanou regulační oblastí. Jako reportéry slouží dvě analyticky odlišitelné luciferázy. Použití kontrolního reportéru umožňuje normalizaci dat a eliminaci nežádoucích vlivu např. cytotoxicity látek.