Intranet English

Analýza proteinů pojivové tkáně


Zvláštní oblast představuje analýza bílkovin, obzvláště bílkovin pojivové tkáně. Nejpodstatnějšími výsledky jsou:

1. Elektroforetická separace bílkovin a jejich fragmentů v kyselých pufrech za přítomnosti vysoké koncentrace povrchově aktivních látek.
2. Dělení peptidů a bílkovin (kolagenu) v kapilárách naplněných polymerem (polyakrylamid, celulóza nebo polymerní detergent) nebo ve vysoce kyselých pufrech.
3. Elektromigrační separace bílkovin založená na sorpční rovnováze s vnitřním povrchem kapiláry ("open tubular capillary electrochromatography").
4. Identifikace kolagenních fragmentů vznikajících působením tkáňové kolagenázy (metaloproteinázy) při plicní hypoxii.
5. Lokalizace fluoreskující složky v kolagenní molekule, která vzniká při neenzymatické glykaci.

Metody, které byly vyvinuty pro separaci kolagenních fragmentů (kapilární elektroforéza v kyselých pufrech) byly úspěšně aplikovány pro kvantifikaci kolagenních typů I, III a V v tkáních.

Všechny tyto analýzy měly za cíl lépe porozumět fyziologické úloze samovolných (chemických) reakcích mezi volnou aminoskupinou (lysin, arginin, N-koncová aminokyselina) pomalu metabolizovaných bílkovin a oxoskupinou endogenních látek (např. aldehydické cukry, peroxidační produkty lipidů). Tyto reakce mají významný vliv jak na normální fyziologické (stárnutí), tak i patofyziologické (diabetes) stavy, tj. na změny biologických funkcí bílkovin. Dalším cílem bylo objasnit úlohu toxických látek schopných modifikovat bílkoviny v životním prostředí, v potravinách a stejně tak odhalit takovéto látky v metabolicky inertních zásobách v tkáních. Souvisejícím aspektem bylo studium kinetiky nízkomolekulárních metabolitů (včetně anorganických iontů) a jejich vazby na složky extracelulární matrice. Pro tyto účely byla vyvinuta metoda umožňující určení vazby olova a zinku na kolagen (nebo jeho fragmenty). Bylo dokázáno, že v kolagenní molekule existují dvě kategorie vazebných míst a jejich počet velmi dobře odpovídá počtu zbytků asparagové a glutamové kyseliny, které jsou k dispozici. Bylo rovněž popsáno, že olovo (po podání ve vodě k pití) je akumulováno v tkáních obsahujících kolagen (placenta a zárodečné obaly).
 

Krmení laboratorních potkanů vysokotukovou dietou se projeví značným zvýšením koncentrace látek obsahujících reaktivní karbonyl v reperfusátu z jejich srdce (tzn. že se zvyšují reaktivní karbonylové sloučeniny schopné reagovat s bílkovinami přítomnými ve vaskulárních stěně). Koncentrace těchto metabolitů může být opět vrácena na hladinu shodnou s kontrolami, jestliže vyměníme vysokotukovou dietu za standardní peletovanou dietu.

Metabolity vznikající z posttranslačních modifikací (glykace) byly nalezeny ve specifických (dvou) kolagenních fragmentech (odhaleno pomocí kapilární elektroforézy v off-line spojení se synchronní fluorescenční spektroskopií). Glykace a modifikace kolagenu metabolity odvozenými od lipidů byly studovány při stárnutí a u hypertriglyceridických (HTG) potkanů. Bylo zjištěno, že koncentrace pentosidinu (specifická dusíkatá látka vznikající při glykaci a měřená pomocí HPLC) s věkem významně vzrůstá jak v kůži, tak i v ocasních šlachách potkanů. Fluorescence (měřená při čtyřech vlnových délkách typických pro produkty vznikající z cukrů nebo lipidů) významně vzrůstá v závislosti na věku pouze u kožního kolagenu. Významné rozdíly mezi HTG a kontrolními zvířaty byly zjištěny pouze při porovnání obsahu pentosidinu u mladých zvířat, u starých zvířat byly hodnoty stejné. Z těchto výsledků bylo vyvozeno, že bílkoviny s pomalým metabolickým obratem jsou v různých pojivových tkáních rozdílně dostupné k posttranslačním modifikacím a výsledky získané z ocasních šlach (používané jako typický model pojivové tkáně) nemůže být automaticky aplikován na jiné měkké pojivové tkáně v těle.

Byly rovněž studovány posttranslační modifikace bílkovin způsobené podáváním alkoholu. Tento výzkum byl prováděn ve spolupráci s Ústavem soudního lékařství, University ve Veroně, Itálie. Byly sledovány a zjištěny změny ve struktuře (složení) bílkovin vlasů (keratinů) a sérového transferinu, které byly způsobeny alkoholem. Tyto modifikace peptidů transferinu mají soudní (diagnostické) důsledky, které mohou být prakticky použitelné.

© 2014 Fyziologický ústav AV ČR