Intranet English

Funkční charakterizace deficiencí ATP syntázy


ATP tvořené mitochondriální FoF1-ATP syntázou představuje hlavní zdroj energie pro aerobní organizmus. Cílem tohoto projektu je charakterizovat funkční dopad deficiencí ATP syntázy na modelu knockdownu malých podjednotek katalytické F1 části ATP syntázy (γ, δ a ε). 

Technikou RNA interference jsme připravili lidské buněčné linie HEK293 s knockdownovanou expresí podjednotek γ, δ a ε. Snížená exprese jednotlivých podjednotek vede ke stejnému konci - ke sníženému množství a aktivitě ATP syntázy. Analýza knockdownovaných klonů nám umožní popsat vliv těchto defektů ATP syntázy na buněčnou energetiku, oxidativní stres, energetický stav a v konečném důsledku i životaschopnost buněk vzhledem k "thresholdu" deficience ATP syntázy, tj. účinnosti knock-downu. Předpokládáme totiž, že některé z funkčních parametrů nebudou nízkou mírou knockdonu ovlivněny a je potřeba dosáhnout určité prahové hodnoty (thresholdu) knockdownu.

 

Projekt navazuje na předcházející studie naší laboratoře:

• Snížená exprese podjednotky ε (Havlíčková et al., 2010) i mutace v její N-koncové části (Mayr et al., 2010) vedou k izolované deficienci lidské ATP syntázy, která je strukturně a funkčně normální. Tento defekt ATP syntázy je doprovázen unikátní akumulací protonoforní podjednotky c. Stejný fenotyp jsme pozorovali i u buněčných linií s knockdownovanými podjednotkami γ a δ, což naznačuje specifickou úlohu malých podjednotek centrálního stonku ATP syntázy v biogenezi a asemblaci celého enzymu. Zbývá doplnit funkční charakteristiky tohoto patofyziologického fenotypu.
• Charakterizace patofyziologického fenotypu mutací TMEM70 u pacientů odhalila dvě primární patogenní složky – jednak narušení mitochondriálního energetického zásobení buňky, jednak zvýšený oxidativní stres jako důsledek hyperpolarizace vnitřní mitochondriální membrány (Mráček et al., 2006; Houštěk et al., 2006). Rozdílný charakter jak mitochondriální energetiky, tak oxidativního stresu mezi jednotlivými fibroblastovými kulturami různých pacientů naznačil rozdílnou úroveň antioxidačních mechanizmů a/nebo kompenzačních změn na úrovni oxidačně-fosforylačního aparátu. Důkladněji charakterizovat mechanizmus patogeneze choroby na molekulární úrovni umožní analýza modelů bez rozdílného jaderného pozadí.

 

Řešení tohoto projektu by mělo vést k objasnění, jaké jsou funkční „thresholdy“ deficiencí ATP synthasy a který ze dvou předpokládaných patogenních mechanizmů, tj. energetická nedostatečnost či oxidativní stres, je důležitější pro následné postižení buněčných funkcí. 

 

Tento projekt je financován Grantovou agenturou Univerzity Karlovy (grant 1160214) a Grantovou agenturou České republiky (grant P303/12/1363).

© 2014 Fyziologický ústav AV ČR