Během několika posledních let byly vyvinuty nové efektivní techniky pro transgenezi potkana a pro inaktivaci genů. Naše oddělení se podílelo na optimalizaci transgeneze pomocí transpozonových vektorů Sleeping Beauty.
Ještě před pár lety nebyly u potkana k dispozici efektivní techniky pro genomové manipulace, což představovalo hlavní nevýhodu při genetických analýzách ve srovnání se studiemi u myší, kde bylo možné inaktivovat geny pomocí modifikací embryonálních kmenových buněk. Transgeneze pomocí transpozonových konstruktů Sleeping Beauty, mikroinjikovaných ve směsi s mRNA hyperaktivní SB100X transpozázy, představuje vysoce efektivní techniku, kdy úspěšnost transgeneze dosahuje 14-72% a většinou dochází pouze k jediné inzerci mimo kódující oblasti genomu. Toho je dosaženo vhodnou koncentrací transpozonového konstruktu a mRNA transpozázy v mikroinjekčním mixu.
Pro inzerci transgenu do jediného definovaného místa v genomu jsme vytvořili 2 nové transgenní SHR kmeny, které nesou výměnnou kazetu se zeleným fluorescenčním genem Venus v nekódujících oblastech chromozomu 2 nebo 16. Pomocí mikroinjekce směsi konstruktu s červeným fluorescenčním proteinem Cherry a mRNA Cre rekombinázy došlo k výměně genu Venus za gen Cherry. Tato RMCE (recombinase mediated cassette exchange) metoda je v současné době optimalizována s cílem zvýšit její efektivitu (ve spolupraci s dr. Zsuzsanna Izsvak (MDC Berlin) a Lajos Mates (Maďarská akademie věd, Szeged)).
Transgeneze pomocí RMCE metody
Kromě vysoce efektivních metod transgeneze jsou u potkana k dispozici nové metody pro inaktivace genů, a to ZFN (Zinc finger nuclease), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) nebo CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/(CRISPR-associated (Cas)). Všechny metody byly v našem oddělení úspěšně aplikovány pro tvorbu potkanů nesoucích mutace specifických genů s cílem získat znalosti o funkci těchto genů.
