Náš výzkumný tým se zabývá studiem 14-3-3 proteinů, což jsou konzervované regulační molekuly exprimované ve všech eukaryotických buňkách. Poprvé byly izolovány z hovězího mozku a jejich zajímavé jméno „14-3-3“ se odvíjí od jejich migrace na DEAE celulosové chromatografii a škrobové gelové elektroforéze. 14-3-3 proteiny mají schopnost se vázat na funkčně rozdílné signální proteiny, včetně kinas, fosfatas a transmembránových receptorů a tím pozměňovat jejich funkci. Tyto proteiny se účastní signální transdukce, kontroly buněčného cyklu, kontroly metabolismu a apoptosy díky strukturním a funkčním změnám řady svých vazebných partnerů. 

Struktura lidského 14-3-3 proteinu (isoforma zeta) s namodelovaným C-koncovým segmentem.

Hledání fosforylačních míst zodpovědných za aktivaci enzymu neutrální trehalasy

Neutrální trehalasa 1 (Nth1) je enzym patřící do skupiny hydrolas, který zajišťuje degradaci neredukujícího disacharidu trehalosy na dvě molekuly glukosy. Obě kvasničné isoformy 14-3-3 proteinů jsou zodpovědné za kompletní enzymovou aktivitu Nth1 po fosforylaci PKA in vitro. V naší práci jsme identifikovali klíčová fosforylační místa zodpovědná za aktivaci tohoto enzymu (seriny na pozicích 60 a 83).

Schéma primární struktury neutrální trehalasy s vyznačenými fosforylačními místy Ser20, 21, 60 a 83, dále vápníkovou a trehalasovou doménou (Veisova et al., 2012).

Kvasničné 14-3-3 proteiny a neutrální trehalasa Nth1
V roce 2010 jsme pomocí série biochemických a biofyzikálních metod dokázali, že C-konec kvasničných proteinů 14-3-3 nefunguje jako autoinhibitor jako u ostatních proteinů této rodiny (Veisova et. al., 2010).
V roce 2012 jsme identifikovali klíčová fosforylační místa zodpovědná za aktivaci enzymu neutralní trehalasy prostřednictvím proteinů 14-3-3 (Veisova et al., 2012).
V současnosti se snažíme enzym neutrální trehalasu blíže charakterizovat. Zjistili jsme, že vazba proteinu 14-3-3 ovlivňuje hned několik oblastí na enzymu Nth1 a tvorba komplexu mezi Nth1 a 14-3-3 je doprovázena změnou v terciární struktuře proteinů (Macakova et al., 2013).

V roce 2014 jsme vyřešili strukturu s nízkým rozlišením pomocí maloúhlového rozptylu světla naznačující, že protein 14-3-3 indukuje strukturní změny v rámci celé molekuly Nth1, zejména ve vápníkové doméně, která je klíčová pro aktivační proces (Kopecka et al., 2014).

Struktura komplexu neutrální trehalasy s proteinem 14-3-3 s nízkým rozlišením obdržená z měření SAXS (Kopecka et al. 2014)

Aktivace neutrální trehalasy prostřednictvím proteinů 14-3-3

Pro studium strukturní podstaty interakce mezi neutrální trehalasou a kvasničným proteinem 14-3-3 jsme použili vodíko-deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií, měření cirkulárního dichroismu a homologní modelování, abychom identifikovali strukturní změny nastávající během tvorby komplexu. Výsledky, které jsme v této práce prezentovali by mohly být důležité k pochopení úlohy proteinu 14-3-3 v regulaci ostatních enzymů.

Model kvasničné neutrální trehalasy s červeně vyznačenými oblastmi, kde dochází k největším změnám při aktivaci enzymu prostřednictvím proteinů 14-3-3 (Macakova et al., 2013).

Současné projekty zahrnují:

1. Úloha vápníku a 14-3-3 proteinů v regulaci neutrální trehalasy
2. Krystalografie neutrální trehalasy.
3. Hledání nových proteinů regulovaných pomocí proteinů 14-3-3