Příběh zvaný cytokinin

MARINA HUŽVÁROVÁ

„Někdy dostanu absolutně hloupý nápad. Třeba jak opětovně procházím všechna data z analýz, všiml jsem si, že jedna látka slabě aktivuje klíčový transkripční faktor oxidativního stresu a má slabou antioxidační aktivitu. Bylo mi divné, proč by se tak měly cytokininy chovat, a tak jsme je pro zajímavost otestovali. A bác! Získali jsme velmi účinnou látku 1521, která se zřejmě uplatní v kosmetice.“ S jiskrou a nadšením vypráví ve své olomoucké pracovně Ústavu experimentální botaniky AV ČR a Centra Regionu Haná pro biotechniologický a zemědělský výzkum prof. Miroslav Strnad příběh muže, jehož nikdy neopustila vášeň zkoumat, co, jak a proč v rostlinách funguje a s čím to souvisí. Komise, jež ho kdysi přijímala k aspirantuře v ÚEB AV ČR, hloubala nad zapáleným studentíkem, který pracoval na obskurním tématu vlivu magnetických polí na růst rostlin jarního ječmene – nikdo tehdy nečekal, že vyspěje v badatele schopného dovést své objevy na molekulární úrovni až do praktického využití v zemědělství, medicíně či kosmetice.

Všechna fota: Stanislava Kyselová, Akademický bulletin
Výzkumy Laboratoře růstových regulátorů Centra regionů Haná, kterou vede Miroslav Strnad, mají těsnou vazbu na Strategii AV21. Výzkumný program Potraviny pro budoucnost, jehož koordinátorem je Ústav experimentální botaniky AV ČR, reaguje na významný společensko-ekonomický problém, jímž je riziko celosvětového nedostatku potravin.

Jak vás zrovna takové téma napadlo?
Tehdy bylo moderní studovat fyzikální účinky elektromagnetických polí na rostliny a magnetické pole bylo podnětné téma. Přesvědčil jsem svého školitele na Vysoké škole zemědělské v Brně, který souhlasil, ale ve vztahu k jeho tématu metabolismu dusičnanů a dusíkatých látek v rostlině – spojil jsem tedy magnetická pole a metabolismus živin, zejména dusičnanů, s rost­linami jarního ječmene. Pokusy jsme dělali s jedním z nejvýznamnějších experimentátorů na Agronomické fakultě VŠZ prof. Rostislavem Richtrem, čímž začala má experimentátorská práce. Pocházím ze staré sed-lácké rodiny, otec Miroslav, stejnojmenný syn, takže jsem se musel potatit. Chtěl jsem do zemědělství, ale otec, který byl v té době agronomem družstva, mě zrazoval: „Chlapče drahý, socialistické zemědělství je strašné, všichni jen kradou, nikdo tě neposlouchá, nikdo nechce dělat…“
Nebyl jsem v partaji, tudíž by mě po studiu nezaměstnali na univerzitě, a tak jsem hledal jinou cestu. Profesor Rostislav Richter s doc. Milanem Kutáčkem, auxinářem, mi jako nadšenému experimentátorovi doporučili konkurz do Ústavu experimentální botaniky. Vědeckou interní aspiranturu jsem zahájil u Ing. Miroslava Kamínka, který se zabýval cytokininy, nicméně jsem začal na jiné skupině rostlinných hormonů – brasinoste-roidech. Tehdy totiž hledali dr. Ivan Černý a dr. Ladislav Kohout z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR někoho, kdo by testoval biologické účinky nově objevené skupiny rostlinných steroidních látek s velmi zajímavými růstově-regulačními účinky. Pracoval jsem tedy na dvou skupinách fytohormonů zároveň. V produktivní spolupráci s ÚOCHB AV ČR na brasinosteroidech dodnes pokračujeme a dosud jsme vyprodukovali mnohé publikace i společné patenty.
U cytokininů jsem dostal zadáno speciální téma vývoje metod na jejich stanovení. Protože se v Praze za aspirantské platy nedalo sehnat slušné bydlení, rozhodli jsme se s manželkou, která pocházela z Hané, přejít do Olomouce, kde už měl náš ústav oddělení šlechtitelských biotechnologií. Nastoupil jsem k doc. Františku J. Novákovi, a aby moje téma zapadlo do koncepce pracoviště, měl jsem se zabývat vývojem imunoanalytických metod. Tím se začalo metodické zaměření našeho pracoviště. Položil jsem základy metod imunoanalýzy na bázi protilátek v Olomouci; ještě za pomoci prof. Blanky Říhové z Mikrobiologického ústavu AV ČR jsem vyvinul vlastní protilátky – právě ona mi poradila, jak připravovat protilátky proti cytokininům. Cytokininy jsem studoval v průběhu somatické embryogeneze vojtěšky, což jsou rostlinné biotechnologie, produkce embryí v baňkách. Ještě během disertace jsme s kolegy z Lékařské fakulty UP vyvinuli i novou, velmi citlivou imunometodu pro stanovení cytostatika methotrexátu, která se dodnes používá k jeho stanovení v erytrocytech u leukemických pacientů. Později jsem se zaměřil na to, zda se aromatické cytokininy (skupina, kterou jsme takto definovali – látky odvozené od 6-benzylaminopurinu – BAP) vyskytují v rostlinách. Desítky let byly totiž známy jako přirozené izoprenoidní cytokininy, ale nikoli aromatické cytokininy.

K tomu jste přistoupil originálním způsobem. Jak jste získal první české rostlinné hormony?
K hledání přírodních látek se zpravidla používá kombinace chromatografických metod a biologicky aktivních testů. Nejdříve jsem ale udělal protilátky specifické pro tyto hormony, následně jsem aromatické cytokininy rozdělil a zkombinoval separační a imuno­analytickou technikou, čímž jsem vlastně urychlil proces hledání těchto látek. V relativně krátké době se podařilo najít látky z této skupiny aromatických cytokininů, které jsem pojmenoval topoliny.

Je název topolin skutečně odvozen od topolu? Jak vás napadl zrovna tento štíhlý vysoký strom, kterých dnes v krajině znatelně ubývá?
Tyto látky se ve velmi vysokých koncentracích skutečně nacházejí v topolech. Opravdu jich ubývá, já jsem ale navíc potřeboval speciální křížence Populus x robusta, kterých bylo relativně málo i dřív. Takže nejdřív mi musel systematik (Ing. Motl) najít na Olomoucku správné topoly, abych poté se starou škodovkou objížděl strom od stromu a po žebříku lezl v bílém plášti trhat listí do kouřící nádoby s dusíkem. To vše za rozbřesku, protože vysoké koncentrace topolinů s východem slunce souvisejí. Ani se nedivím, že mě někdy zastavovali příslušníci VB, co to dělám. Topol jsem nezvolil úplně náhodou. Prof. Roger Horgan z Anglie již předtím izoloval jeden z aromatických cytokininů a mně se podařilo nalézt několik dalších. Ten nejúčinnější byl meta-topolin. Samozřejmě jsem hledal hormony i v jiných rostlinných druzích, ale ne ve všech jsou vysoké koncentrace a ne ve všech se mi je podařilo najít.
Ukázalo se, že aromatické cytokininy mají silné morfogenetické účinky, stimulují organogenezi v rost­linných tkáňových kulturách, a především vedou k tvorbě velkého množství výhonů, což má praktické uplatnění, protože se dnes část rostlin – okrasných i zemědělsky významných – množí technikami in vitro. Měli jsme tedy aktivní cytokininy a začali jsme hledat a vyvíjet látky pro praktické využití v rostlinné biotechnologii. Nový obor jsme nazvali biologickou chemií (zabývá se jí dr. Karel Doležal). Protože nelze množit pomocí jednoho cytokininu všechny rostlinné druhy, snažíme se vyvíjet látky s druhovou specifitou a rozdílnou metabolickou stabilitou.

Modelové rostliny Arabidopsis (huseníček) ošetřené cytokininy

Trochu mi to připomíná reprodukční medicínu. Ovšem ve vašem případě cílíte přímo na pole!
Tuto analogii lze použít. Hormony pro reprodukci rostlin, vegetativní množení, de facto klonování, známé z pracných pokusů u živočichů, jsou životní samozřejmostí u rostlin – rozdíl životních strategií. Díky práci dr. Lukáše Spíchala a Radoslava Koprny se nám podařilo vybudovat infrastrukturu, která má obrovský potenciál v základním výzkumu: objevování nových látek, přípravě transgenních organismů, studiu mechanismů, jak cytokininy fungují v rostlinách, jak jsou transportovány, máme knock-outy, tedy rostliny s oslabenými účinky daných genů, což potřebujeme ke studiu účinku rostlinných hormonů in planta apod. Zároveň se podařilo vybudovat unikátní a ve světě ojedinělý systém, který umožňuje vývoj látek pro zemědělství – rostlinnou výrobu, a to od zkoumání molekulárního mechanismu účinku přes buněčné biotesty po fenotyping (čili přesný záznam účinku daných látek v kontrolovaných podmínkách) až po jejich použití na poli. I velké firmy a nadnárodní společnosti, které se zabývají vývojem růstových regulátorů, jsou překvapeny úrovní, které jsme dosáhli, a jsou našimi stále častějšími hosty.

Hovořili jsme o nezastupitelné úloze aromatických cytokininů při vegetativním množení, co dalšího „dokázaly“ u rostlin ve vašich službách?
Mým oblíbencem je molekula, která funguje jako „prodrug“ – slovo pochází z farmacie a v zemědělství se zatím takové látky nepoužívají. V takové podobě látka neovlivňuje růst kořenů, tedy nefunguje jako cytokinin, nýbrž se po transportu do nadzemních částí chová jako prekurzor, z něhož vznikne aktivní cytokinin stimulující růst rostlin. Výši hladiny prekurzoru můžeme ovlivňovat, stále je ovšem třeba „hlídat“ jeho stabilitu i lokalizaci, aby se nám v rostlině neztratil. Zjistili jsme, že je to vynikající transportní forma, která se rozštěpí v listech a působí jen v nadzemní části rostliny. Tento poslední patent zvyšuje u závlahové zeleniny, např. rajčat, sklizeň o více jak 20 %, což bylo potvrzeno ve zkouškách Kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského (ÚKZUS). Testujeme několik dalších podobných látek a snažíme se o spolupráci zejména v oblastech, kde se používá kapková závlaha. Máme například dohodu s Izraelci, kteří u Mrtvého moře pěstují na tisících hektarech skleníkové plochy papriku.
Další příležitost pro naše cytokininy je spojena s jejich schopností indukovat produkci etylenu – plynného hormonu rostlin využívaného třeba ke zrání banánů. Některé cytokininy zase způsobují opad listů bavlníku, což umožňuje jeho mechanickou sklizeň. Nám se podařilo vyvinout látky, které ztratily cytokininovou aktivitu a zůstala jim jen ta, která jim umožňuje vyvolat tvorbu etylenu. Dokonce jsme již podepsali smlouvu s jednou zahraniční firmou.

Struktura izoprenoidních a aromatických cytokininů a jejich metabolity

Vím ovšem, že vaše cytokininy překročily hájemství rostlinného světa a můžeme je potkat i v tak odlehlých oblastech živé přírody, jako jsou bakterie. Nemýlím se?
Nemýlíte se; mohu potvrdit, že i nás překvapilo setkání s cytokininy, k němuž došlo zcela nedávno. Identifikovali jsme totiž para-topolin v Bacillus tuberculosis. Cytokinin, který postrádá biologickou aktivitu v rostlinách, se ale významně podílí na regulaci infekčnosti bakterií tuberkulózy. Bakterie totiž syntetizují cytokinin a udržují jeho nízkou hladinu, aby se bránily oxidu dusnatému, což je podmínkou pro zachování jejich vysoké infekčnosti, což je důležitý poznatek s lékařskými implikacemi v době, kdy se tuberkulóza opět šíří. Práci jsme letos ve spolupráci s americkými kolegy publikovali v Molecular Cell (57, 2015).

Znamená to tedy, že cytokininy mohou představovat vývojově velmi staré látky?
Snažíme se to nyní prokázat a pokoušíme se vytvořit evoluční stromy vývoje metabolických drah u jednotlivých organismů. Dostáváme se na úroveň sinic, kde jsme již udělali screening, a následně budeme pokračovat u bakterií. Během evoluce se postupně jednotlivé skupiny cytokininů směšovaly. Zatím můžeme jen konstatovat, co se více podobá bakterii. Ty mají většinou jen isopentenyladenin, i když výjimky rovněž existují. Jak se vyčleňují sinice, objevují se i další cytokininy. Evolučně se to vlastně rozšiřuje ve vyšší rostliny, které produkují největší množství cytokininů i dalších rostlinných hormonů. Když sestavíme evoluční stromy, pochopíme, jak tyto látky fungují v rostlinách a odkud pocházejí.

Dostáváme se nyní k jedné z posledních oblastí vašeho zájmu. S cytokininy jste překročili do oblasti humánní medicíny již vícekrát…
Komplexní znalost účinku cytokininů opravdu umož­nila extrapolaci některých jejich efektů i mimo rostlinný svět. Když jsem našel meta-topolin, zaujalo mě, proč tak intenzivně stimuluje buněčné dělení. Neregulují cytokininy komplexy cyklin-dependentních kináz s cykliny, které jsou motorem mitózy? Vedlo to k objevu olomoucinu, molekuly cytokininu s malými modifikacemi, která proměnila látku určenou pro stimulaci buněčného dělení v pravý opak – látku, která jej blokuje. Tak začal vývoj selektivních protinádorových látek na bázi cytokininů. Olomoucin a olomoucin II jsou velmi specifické inhibitory CDK, které inhibují jen málo dalších kináz, což nebývá běžné. Látky pocházejí zejména z dlouhodobé spolupráce s doc. Liborem Havlíčkem z Izotopové laboratoře ÚEB. Snažili jsme se vyvinout opravdu hodně selektivní inhibitory a obecně se zaměřujeme nejen na mitotické CDK, ale i na CDK regulující transkripci a řadu dalších terapeuticky zajímavých kináz. To je nyní hlavní náplní týmu doc. Vladimíra Kryštofa. Některé z námi vyvinutých antiproliferačních látek se v zahraničí (Skotsko, USA) dostaly do vyšších stupňů klinického testování. Píšeme publikace, patentujeme a teď se snažíme i vyvinout „management“ systém, jak tyto další, velmi účinné látky dostat do klinické praxe. Dlouhodobě se zabýváme využitím cytokininů v kosmetice, protože zpomalují stárnutí nejen rostlinných pletiv, ale i kožních buněk u lidí, brzdí rozpad keratinu a udržují hydrataci kožních tkání. A nejen to – u živočišných buněk byl zjištěn protinádorový účinek přirozených cytokininů a některé deriváty mají také vliv na diferenciaci buněk. V rost­linách souvisí mechanismus stárnutí (senescence) s degradací chlorofylu, ale proč cytokininy způsobují rejuvenizaci u živočišných buněk, přesně nevíme. Obecně to spojujeme s projevy cytokininů jako anti­oxidantů a induktorů mechanismů eliminujícími oxidativní stres. Studujeme tedy jejich zapojení do regulace klíčových drah oxidativního stresu. Při vývoji komerčně využitelných látek jsme se inspirovali i přístupy a zkušenostmi osvojenými v zemědělských aplikacích. Vývoj účinné látky vede přes molekulární a buněčné mechanismy, testování v modelových situacích až po finále u člověka. Ve spolupráci dokážeme vyvinout a vyrobit mast, zajistit její testování a zjistit její bezpečnost. Nakonec se na základě patentů podařilo účinnou látku, derivát kinetinu, licencí zhodnotit. Má kos­metické i dermatologické účinky. Omlazuje fenotyp kožních buněk, odstraňuje vrásky a je použi­telná při léčení zarudlosti kůže, růže, růžovce apod. V současnosti je v prodeji jako americký produkt (Pyratine 6) i na našem trhu.

Rostliny jahodníku množené in vitro pomocí cytokininů

Stále tu zaznívá, že cytokininy představují určitý můstek mezi rostlinnými a živočišnými stresy. Kde hledat paralely?
Paralela je veliká a závisí na drobných modifikacích. I prof. Antonín Holý, s nímž jsme hodně spolupracovali, si de facto celý život hrál s drobnými modifikacemi právě u purinových molekul, protože si uvědomil, že můžete mít velmi podobné látky, z nichž jedna je virostatikem proti HIV a jiná proti žloutence. S cytokininovou molekulou se trochu lišíme, protože jeho látky neměly většinou cytokininový N6-substituent. Pro nás je důležité obšírně studovat mechanismy účinku velmi divergentních molekul a jejich modifikacemi se dostat do jiných aplikačních oblastí. Teď vyvíjíme skupinu velmi účinných derivátů, které regulují klíčový transkripční faktor odpovědi na stres a zasahují do systému oxidativního stresu. Nejznámější látka, jejíž klinické zkoušení bylo zastaveno, je dimethyl fumarát. My máme látky, které jsou dokonce desetinásobně účinnější než tento nejaktivnější regulátor, a předpokládáme u nich využití při léčení roztroušené sklerózy. Přemýšlíme, s kým spolupracovat při testování účinků na nervových buňkách, astrocytech apod.

Nakolik se vám daří spolupracovat s lékaři? Kterou experimentální oblast považujete za svůj střežený rajon?
Naše látky bohužel nedostaneme až do klinického zkoušení – potřebovali bychom minimálně desítky milionů korun. Navíc nejsme lékaři, takže nemůžeme nic klinicky testovat. Ale v kosmetice se dostáváme ve spolupráci s kliniky až k testům s pacienty. Dokážeme vyvinout a vyrobit mast, zajistit její preklinické testování a ověření její bezpečnosti a vstoupit i do klinického zkoušení. Ve farmacii chceme pouze zvýšit hodnotu látek tím, že provedeme preklinické testy na zvířatech kvůli bezpečnosti, ověříme, že látky nejsou mutagenní, toxické, jsou dobře vstřebatelné, metabolicky dostatečně stabilní atd.
Máme například účinnou látku na hepatokarci­nomy (nádory jater), kdy metastázující nádor doprovází zánět, velké množství buněk migruje a vytváří metastázy, čímž se stává tento typ nádorů velmi komplikovaným a těžce léčitelným (výsledek týmu doc. Vladimíra Kryštofa). Hledáme v Česku partnera, který by „dotáhl“ naše látky do klinického zkoušení, ale snažíme se také vyvinout systém, jak najít cestu k uplatnění látek na světovém trhu. Umět nabídnout výsledky celosvětově a zajistit jejich komercionalizaci považuji totiž za opravdové umění.
V problematice analýzy rostlinných hormonů, kterou se zabýváme nejdéle, jsme opravdu nejlepší na světě a jsem na to hrdý. Je to z velké části zásluhou týmu dr. Ondřeje Nováka. Vyvinuli jsme robustní metody poskytující stabilní výsledky, což souvisí také s rozvojem fytohormonální chemie a s tím, že jsme sami začali syntézu těchto látek rozvíjet. Oblast cytokininů neměla interní standardy pro kalibraci, neexistovaly jednotlivé látky, jako metabolity. Trvalo nám 10 i více let, než jsme všechny tyto látky a standardy připravili a zásadně tak rozšířili spektrum analyzovaných skupin rostlinných hormonů. Kdysi mně doc. Jan Krekule varoval před gibereliny, že jsou nezvladatelné. Zvládli jsme nejen jejich analýzu, ale dr. Dana Tarkowská umí kvantifikovat a identifikovat velkou část jejich metabolomu, který představuje více jak 130 látek. Dokážeme zmapovat velkou část metabolických drah citlivými metodami, které pracují na úrovni atomolární až zeptomolární – 10–18 –10–21 molu. Díky velmi kvalitní fytohormonální syntéze jsme si vybudovali portfolio látek, značených standardů, a vyvinuli vlastní technologie analýzy, které zaručují bohatou spolupráci s externími subjekty.

Krém PyratineXR na bázi derivátu kinetinu s omlazujícími a léčebnými účinky

Aplikační proces je velmi náročný technicky i finančně. V zemědělství jste ho zvládli, ale také již výše zmíněná kosmetika vám přináší zisk, i když nepřímo. Patenty rovněž nejsou levná záležitost…
Spojili jsme se s malou zahraniční firmou, která nám podle smlouvy platí veškeré patentové náklady „kosmetických“ patentů a částečně nás podporuje i ve výzkumu. Náklady na mezinárodní ochranu tří patentů celosvětově a desítek dalších patentů představují obrovskou sumu sta tisíc dolarů, několika milionů korun ročně, což by si ústav nemohl dovolit platit. Naše patenty teď mají ochranu v 70 zemích světa, do tolika bychom ani sami patenty neprodali. A navíc, pokud by firma zvýšila obrat nad určitou hranici nebo naši látku prodala jinému subjektu, dostali bychom zaplaceno za licenci či sublicenci. Věříme, že nějaké zisky tato licence ještě přinese.

Je to tedy jakési zlaté vejce v líhni. Máte ještě další? A jak překročit hranici kosmetiky a dostat se do farmacie?
Vrátím se k mykobakteriím – zde je zlatým vejcem látka para-topolin, kterou jsem našel kdysi v rostlinách, a je biologicky zcela neaktivní. Příroda je ale mocná a stačí málo, aby byla látka aktivní nebo ne. Para-topolin způsobuje vybělování kůže, což zajímá zejména Asiaty, kteří dokončují klinické zkoušky a jimž připravujeme stabilitní zkoušky masti, tedy vkládáme aplikovanou část. Krém na bázi para-topolinu by se měl zřejmě letos dostat na trh.
Zásadní problém ve farmacii je, že sami naše látky s protinádorovými účinky nedostaneme do klinického zkoušení, neboť náklady na tento vývoj se pohybují v desítkách až stovkách milionů korun. Můžeme pouze zvýšit jejich hodnotu preklinickým otestováním na zvířatech a zjištěním, zda jsou látky účinné, nejsou mutagenní, toxické apod. Oproti zemědělství, kde se zájemci o naše unikátní technologie a know-how sami ucházejí, ve farmacii je tomu naopak a taky konkurence je o dva řády vyšší. Zhruba před 10–15 lety nastala obrovská změna na farmaceutickém trhu, velké farmaceutické firmy omezují svůj vlastní originální vývoj, který stojí stamiliony dolarů, protože v Evropě a hlavně Americe vznikla spousta spin-off firem na základě konkrétních objevů nebo nápadů. Farmaceutické firmy si teď jen vybírají „jednohubky z podnosu“ – z několika klinicky ověřených látek si nějakou vyberou a koupí celou spin-off firmu. Ušetří tak obrovské náklady za riskantní vývoj. Někdy se také látky prodají (licencují) na základě spolupráce, zejména pokud jde o úzce vymezený molekulární cíl. Občas se stane, že nějaká malá firma neuspěje se svým záměrem a tak horečně hledá náhradní látku. Důležité je umět v tu chvíli nabídnout na správných místech vlastní látku, která je prokazatelně účinná a není nebezpečná. Proto v rámci projektů komercializace budujeme v ÚEB i UP infrastrukturu, která by nám umožnila se dostat mezi „žraloky“. Samozřejmě hledáme i české partnery.

Jan Krekule a Miroslav Strnad cestou olomouckým areálem v živé diskusi o zaměření výzkumu fytohormonů.

Koho považujete za svého nejzajímavějšího vědeckého kolegu?
Velmi si vážím prof. Thomase Schmüllinga ze Svobodné university v Berlíně, s nímž spolupracuji více jak 20 let; udělali jsme spolu množství vynikajících prací, které se týkají cytokininové biosyntézy, degradace a signalingu. Jde o klíčové práce fyziologie rostlin z oblasti cytokininů. Jeden z významných objevů, kterého jsme se teď účastnili, se týká akropetálního transportu cytokininů (z kořenů do vrcholu), jehož mechanismy nebyly dosud dokonale známy. Ve spolupráci s jednou americkou skupinou jsme k tomu publikovali článek v Nature Communications. Práce je srovnatelná s objevem PIN proteinů zapojených do polárního transportu auxinu.

K rozhovoru jsme se sešli na okraji Olomouce v rozlehlém areálu – nakolik je pro vás důležité spojení olomoucké univerzity a Akademie věd?
Když vzniklo Centrum regionu Haná, spojil se ÚEB AV ČR s Výzkumným ústavem rostlinné výroby zaměřeným na aplikace a Univerzitou Palackého. Získali jsme rozsáhlé pozemky kolem celého areálu, což nám umožnilo další rozvoj. Látky, o nichž mluvíme, vznikají společným výzkumem několika institucí a důležitý benefit spočívá v tom, že je nakonec dostaneme právě na vlastní pole.