Neurosteroid pregnenolon sulfát - odhalení místa jeho působení na N-methyl-D-aspartátový receptor (26.10. 2020)

NMDA receptory jsou iontové kanály podílející se na přenosu elektrického signálu mezi nervovými buňkami. Jejich snížená funkce přispívá k řadě závažných neuropsychiatrických onemocnění, jako například ke schizofrenii, či autismu. Aktivita NMDA receptorů může být zvýšena prostřednictvím nejrůznějších látek včetně neurosteroidů.  Ve spolupráci s Ústavem organické chemie a biochemie AV ČRse nám podařilo odhalit vazebné místo a objasnit mechanismus působení pro přirozeně se vyskytující neurosteroid pregnenolon sulfát (PES). PES se váže na rozhraní membránových domén NMDA receptoru v zavřeném stavu, což po následné aktivaci receptoru pomocí glutamátu vede k přeuspořádání membránových domén a stabilizaci otevřeného stavu iontového kanálu NMDA receptoru. Dané poznatky mohou přispět k vývoji nových látek pro léčbu onemocnění spojených s nedostatečnou funkcí glutamátergního systému.

Interakce molekuly PES (zeleně) s membránovými doménami NMDA receptoru v otevřeném stavu získaná dokováním následovaným molekulárně-dynamickou simulací. Aminokyseliny zapojené do interakce s molekulou PES jsou vyznačeny červeně.

Hrčka Krausová B, Kysilov B, Černý J, Vyklický V, Smejkalová T, Ladislav M, Balík A, Kořínek M, Chodounská H, Kudová E, Vyklický ml. L. Site of Action of Brain Neurosteroid Pregnenolone Sulfate at the N-Methyl-D-Aspartate Receptor. Journal of Neuroscience. 2020; 40 (31) 5922-5936. IF: 5.673 

Dietní suplementace olejem z Krilu jako nová strategie ke zlepšení citlivosti organismu k inzulínu a snížení akumulace tuku v játrech při obezitě (20.10. 2020)

Změna životního stylu zahrnující i zdravou výživu představuje důležitou součást strategie prevence i léčby negativních metabolických důsledků obezity. Olej z Krilu jako extrakt z antarktického krilu Euphausia superba (tj. korýšů vyskytujících se v antarktických vodách) je relativně novým zdrojem omega-3 polynenasycených mastných kyselin (Omega-3). Bylo prokázáno, že doplňky stravy obsahující Omega-3, obvykle podávané ve formě koncentrátu na bázi triacylglycerolů nebo ethylesterů, mohou snížit zánět a nadměrné ukládání tuku v játrech (tj. jaterní steatózu).

U obézních pacientů s diabetem 2. typu však podávání těchto forem Omega-3 nemusí nutně vést ke zlepšení citlivosti organismu k inzulínu, a navíc může zhoršit dlouhodobou kontrolu metabolismu glukózy. Proto jsme na obézních myších testovali, zda podání Omega-3 navázaných na jiný lipidový nosič, v tomto případě na fosfolipidy v krilovém oleji, může mít příznivé metabolické účinky a zároveň zlepšit metabolismus glukózy a citlivost organismu k inzulínu.

Naše studie prokázaly, že suplementace krillovým olejem dokáže snížit steatózu jater více než Omega-3 podávané ve formě triacylglycerolů, a tento účinek krillového oleje byl doprovázen zlepšenou inzulínovou citlivostí na úrovni jater i celého těla. Příznivý účinek krilového oleje na glukózovou homeostázu byl spojen nejen se zlepšenou biologickou dostupností Omega-3 (např. EPA, n-3 DPA) ve tkáních, ale také s cirkulujícími hladinami kyseliny palmitolejové, již dříve identifikovaného lipokinu (tj. hormonu lipidové povahy) s inzulín-senzitizujícími vlastnostmi, jehož obsah je v krilovém oleji zvýšen. Kromě toho olej z krilu účinněji než Omega-3 na bázi triacylglycerolů indukoval katabolismus mastných kyselin v tenkém střevě. Tento proces by tak mohl přispívat k silnému antisteatotickému účinku krilového oleje. Naše výsledky poskytují obecné zdůvodnění pro použití fosfolipidů s obsahem Omega-3 jako doplňků výživy se silnými inzulín-senzitizujícími a antisteatotickými účinky.

Samci C57BL/6N myší byli krmeni po dobu 8 týdnů dietou s vysokým obsahem tuku na bázi kukuřičného oleje (cHF) nebo doplněnou koncentrátem Omega-3 obsažených v triacylglycerolech (cHF+ω3TG) nebo fosfolipidech z krilového oleje (cHF+ω3PL); štíhlé kontroly byly krmeny nízkotučnou standardní dietou (A). Podávání cHF zhoršilo citlivost k inzulínu (stanoveno měřením rychlosti infůze glukózy během hyperinzulinemické-euglykemické svorky;  B – nahoře) a způsobilo výraznou akumulaci lipidů v játrech (tj. steatózu jater;  B – dole). Zatímco u cHF+ω3PL myší byla citlivost k inzulínu téměř zachována a jaterní steatóza prakticky eliminována, u cHF+ω3TG myší byly pozorovány mnohem méně výrazné účinky. Příznivé metabolické změny pozorované po podání krillového oleje mohou souviset se zvýšenými hladinami inzulín-senzitizujícího lipokinu palmitoleátu (POA) v cirkulaci (C – nahoře) a zvýšeným katabolismem mastných kyselin přímo ve střevní tkáni (C – dole).

Rossmeisl M, Pavlisova J, Bardova K, Kalendova V, Buresova J, Kuda O, Kroupova P, Stankova B, Tvrzicka E, Fiserova E, Horakova O, Kopecky J. Increased plasma levels of palmitoleic acid may contribute to beneficial effects of Krill oil on glucose homeostasis in dietary obese mice. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2020;1865(8):158732. IF: 4.519

Kroupova P, van Schothorst EM, Keijer J, Bunschoten A, Vodicka M, Irodenko I, Oseeva M, Zacek P, Kopecky J, Rossmeisl M, Horakova O. Omega-3 Phospholipids from Krill Oil Enhance Intestinal Fatty Acid Oxidation More Effectively than Omega-3 Triacylglycerols in High-Fat Diet-Fed Obese Mice. Nutrients. 2020;12(7):2037. IF: 4.546

Nový mechanismus výlevu inzulinu poukazuje na důležitost redoxní signalizace (14.10. 2020)

Výlev inzulinu β buňkami pankreatických ostrůvků je esenciální pro udržení glukozové homeostázy v těle. Jeho porucha je příčinou cukrovky. Mechanismus výlevu byl donedávna úzce spjat výhradně se zvýšenou koncentrací energetické molekuly ATP v buňce, která iniciuje kaskádu výlevu inzulinu. Naše výsledky ukázaly, že kromě ATP je pro efektivní inzulinový výlev důležitá redoxní signalizace uvnitř β buňky. Konkrétně jsme poukázali na enzym NADPH oxidázu, izoformu 4, jejíž aktivita se zvýší po stimulaci β buňky glukózou. To vede ke krátkodobému zvýšení pro-oxidační molekuly, peroxidu vodíku, který spolu s ATP navodí výlev inzulinu. Výsledky poukazují na důležitou roli redoxní signalizace ve fyziologii β buňky.  

Plecitá-Hlavatá L, Jabůrek M, Holendová B, Tauber J, Pavluch V, Berková Z,  Cahová M,  Schröder K, Brandes R.P, Siemen D, Ježek P Glucose-Stimulated Insulin Secretion Fundamentally Requires H(2)O(2)Signaling by NADPH Oxidase 4 . Diabetes. 2020; 69(7); 1341-1354,IF: 7.720

Detailní charakterizace redoxního prostředí β buňky přispěje k pochopení mechanismu výlevu inzulinu

Důležitost redoxní signalizace při výlevu inzulinu, jakožto reakce na zvýšenou hladinu glukózy v těle  jsme popsali v publikaci výše. Důležitý enzym v tomto mechanismu je cytosolická NADPH oxidáza. Je ale známo, že mitochondrie kromě energetické molekuly ATP taktéž produkují superoxid a jiné kyslíkové reaktivní radikály, které by potenciálně mohly ovlivnit celkový redoxní stav β buňky a tím ovlivnit výlev inzulinu. V této práci jsme zjistili, že indukce glukózou naopak způsobí pokles produkce superoxidu v mitochondriích a popsali jsme molekulární mechanismus, jak k tomu dochází. K výzkumu jsme mimo jiné využili nové sondy a metodu fluorescenční mikroskopie umožňující sledování změn redoxního stavu v reálném čase v jednotlivých kompartmentech buňky.

(A) Nový molekulární mechanismus výlevu inzulinu vyzdvihující roli redoxní signalizace u β buněk, kterou lze indukovat různými substráty (glukóza, mastné kyseliny (FA), aminokyselin (AA), Arginin (Arg)).

(B, C) Popis hlavních metabolických a redoxních toků v β buňce při klidové hladině glukózy (B, nezpůsobující výlev inzulinu) a vyšší hladině glukózy indukující výlev inzulinu (C).

Plecitá-Hlavatá L, Engstová H, Holendová B, Tauber J, Špaček T, Petrásková L, Křen V, Špačková J, Gotvaldová K,Ježek J, Dlasková A, Smolková K, Ježek P Mitochondrial Superoxide Production Decreases on Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Pancreatic beta Cells Due to Decreasing Mitochondrial Matrix NADH/NAD(+) Ratio . Antioxidants & Redox Signaling. 2020; 33(12); 789-815 . IF: 6.323

Losartan snižuje neuropatickou bolest a zánět u modelu periferní neuropatie vyvolané podáváním cytostatika Paclitaxel (13.10. 2020)

Léčba onkologických pacientů paclitaxelem často vede k rozvoji periferní neuropatie, neuropatické bolesti a zánětlivým změnám v periferní a centrální nervové soustavě. Dostupná analgetická léčba bolesti u těchto stavů má výrazné nežádoucí účinky a je velmi málo účinná. Je proto potřeba pochopit mechanismy vzniku těchto neuropatických stavů, abychom mohli vyvinout nové léky, které by bolest tlumily lépe. Bylo ukázáno, že běžně používaný lék na léčbu vysokého krevního tlaku losartan, může mít u modelů jiných onemocnění protizánětlivé a neuroprotektivní účinky.  V naší práci jsme ukázali, že systémové podání losartanu výrazně oslabilo mechanickou allodynii (bolest na slabé mechanické podněty) u potkanů, u nichž byla navozena neuropatická bolest podáváním paclitaxelu. Losartan současně také významně snížil paclitaxelem navozené zánětlivé změny a navodil expresi protizánětlivých markerů, naznačující možný posun v polarizaci makrofágů. Vzhledem k dobrému profilu nežádoucích účinků losartanu by bylo možné zvážit jeho podávání jako možný nový nástroj na omezení vzniku neuropatické bolesti u pacientů léčených paclitaxelem.

Kalynovska N, Diallo M, Sotáková-Kašparová D, Paleček J Losartan attenuates neuroinflammation and neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 14 (2020), 7949-7958. IF: 4.486

Cílená modulace signálních drah v buňce novým typem agonistů muskarinových receptorů, může vést k vývoji léčiv bez vedlejších účinků. (22.7. 2020)

V současné době více než třetina všech léčiv na trhu cílí na receptory v membránách buněk, které jsou spřaženy  s vnitrobuněčnými signálními G‑proteiny (tzv. GPCR). Tento typ membránových receptorů se podílí na řízení široké škály fyziologických procesů, počínaje zpracováním smyslových podnětů, přes regulaci chování a nálady, hormonální a imunitní odpovědi až po řízení autonomních funkcí a buněčné proliferace. Proto tyto receptory obecně představují jeden z nejdůležitějších farmakoterapeutických cílů. Tradiční agonisté GPCR aktivují v buňkách obvykle vícero signálních drah, což může mít za následek řadu vedlejších účinků. Látky vedoucí výlučně k aktivaci jedné  signální dráhy představují novou generaci vysoce specifických léčiv s méně vedlejšími účinky. Velké úsilí bylo dosud věnováno výzkumu látek vedoucích buď k aktivaci G‑proteinových drah, nebo k signalizační kaskádě přes β‑arrestiny.

V naší laboratoři se zaměřujeme na studium muskarinových acetylcholinových receptorů, které patří k typickým představitelům GPCR. V naší publikaci představujeme zcela nový typ agonistů těchto receptorů, kteří dokážou specificky modulovat signální dráhy na úrovni spřahování receptoru s jednotlivými podtypy G‑proteinů (Obrázek 1A). Zmíněné látky působí výhradně na signální dráhu přes protein Gi, která vede k inhibici adenylát cyklázy a tím ke snížení hladiny cAMP v buňce (Obrázek 1B). Díky tomu jsou tyto látky funkčně selektivní pro  muskarinové receptory M2 a M4, jež představují jeden z farmakologických cílů při léčbě bolesti. Nově objevení agonisté mohou vést k vývoji nových analgetik nezpůsobujících návyk jako opiáty, nebo oslabení imunity jako steroidní analgetika. Tato muskarinová analgetika by nezpůsobovala vedlejší účinky zprostředkované  aktivací signální dráhy přes protein Gq, jako je inkontinence, nadměrné slinění a pocení a další.

A) Obecné schéma spřahování GPCR s jednotlivými podtypy G-proteinů nebo arrestiny po aktivaci agonistou tradičního typu (vlevo) a agonistou preferujícím aktivaci Gi-proteinu (vpravo). AC, adenylát cykláza; PLC fosfolipáza C. B) Aktivace M2 receptoru tradičním agonistou (modře) stimulujícím Gi i Gs-proteinovou dráhu, což vede ke snížení hladiny cAMP v buňce při nízkých koncentracích agonisty a k nárůstu koncentrace cAMP při vyšších koncentracích agonisty. Aktivace M2 receptoru dvěma různými Gi-preferujícími (Gi-biased) agonisty (červeně, oranžově) stimulujícími pouze Gi-proteinovou dráhu, což vede pouze ke snížení hladiny cAMP.

Randáková A, Nelic D, Ungerová D, Nwokoye P, Su Q, Doležal V, El-Fakahany EE, Boulos J, Jakubík J. Novel M2-Selective, Gi-Biased Agonists of Muscarinic Acetylcholine Receptors. British Journal of Pharmacology. 2020; 177(9); 2073-2089 . IF: 7.730