Dneska jsme si pro Vás připravili krátký popis metody dělení pylu, kterou využívá Laboratoř biologie pylu. Text a názorný obrázek pro Vás připravila Lenka Záveská Drábková.

Při studiu biologie pylu je potřeba občas získat čisté frakce jednotlivých vývojových stádií pylu. V případě huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) se jedná o jednobuněčné mikrospory, dvojbuněčná a trojbuněčná stádia pylu a zralý pyl. Tato stádia se mohou separovat v závislosti na dalším využití například pomocí Percollova gradientu založeného na separaci dle hustoty. Jak takové hustotní oddělování vývojových stádií pylu probíhá? Hustotní gradient Percoll obsahuje částice koloidního oxidu křemičitého o průměru 15–30 nm, které jsou potaženy polyvinylpyrrolidonem. Vzorek nanesený na gradient (používáme 10-75%) je centrifugován při určité rychlosti (450g), až do rozdělení buněčných typů do fází v závislosti na jejich hustotě, jedná se o plynulou změnu hustoty v celém rozsahu zkumavky. Zjednodušeně lze říci, že se buňky na gradientu usazují v oblasti totožné hustoty. V našem případě používáme na rozdělení všech vývojových stádií tři gradienty (A-C). V prvním gradientu (A) odseparujeme zbytky sporofytických tkání a chloroplastů od směsné pylové frakce. Pylovou frakci rozdělíme na druhém gradientu (B), kde získáme mikrospory (UNM), směs mikrospor s dvoubuněčnými stádii (UNM a BCP) a trojbuněčný pyl (TCP). Směs UNM a BCP dále dělíme na gradientu C, v němž obdržíme čisté frakce mikrospor (UNM) a dvoubuněčného pylu (BCP). Čistotu separovaných frakcí nakonec ověřujeme mikroskopicky (na obrázku vývojová stádia pod UV vizualizována DAPI) a využijeme je v dalším výzkumu.

Použití hustotního gradientu je velice široké, nejen v rostlinné biologii, lze jím oddělovat i buňky, organely či viry. Zajímavostí je, že se využívá například i pro oddělování viabilních spermií při stále častější asistované reprodukci člověka.

Podrobný protokol najdete v článku z naší laboratoře publikovaném v Nature Protocols (Dupľáková et al., 2016).