Cílená modulace NMDA receptorů je klíčová pro efektivní léčbu neurologických a neurovývojových onemocnění (14.10. 2021)

N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou glutamátem aktivované iontové kanály, které se zásadně podílejí na excitačním synaptickém přenosu a jsou klíčové pro procesy učení a paměti. Jejich narušená funkce vede k závažným neurologickým, neurovývojovým a psychiatrickým chorobám jakými jsou například schizofrenie, poruchy autistického spektra, epilepsie či Alzheimerova choroba. Pro efektivní návrh nových léčiv schopných cíleně modulovat NMDA receptory je nezbytné detailně porozumět nejen struktuře receptoru na atomární úrovni, ale rovněž i odhalit konkrétní sekvenci konformačních změn, které se uplatňují při jeho aktivaci a alosterické modulaci.

Za využití metody single-molecule FRET jsme popsali a kvantifikovali sekvenci konformačních změn NMDA receptoru v jeho amino-terminální doméně, které za fyziologických podmínek vedou k aktivaci receptoru. V neposlední řadě jsme pak odhalili rozdílné úlohy receptorových podjednotek při aktivaci receptoru a identifikovali molekulární mechanismus, jakým snížení pH za patofyziologických podmínek (např. při mrtvici) vede ke snížení funkce receptoru.

Vyklický, Vojtěch - Stanley, Ch. - Habrian, Ch. - Isacoff, E. Y. Conformational rearrangement of the NMDA receptor amino-terminal domain during activation and allosteric modulation. Nature Communications. Roč. 12, č. 1 (2021), č. článku 2694. ISSN 2041-1723. E-ISSN 2041-1723, IF: 14.919, rok: 2020, DOI  

Strukturní podstata teplotní aktivace TRP kanálů (12.10. 2021)

TRPV3 je iontový kanál podílející se na detekci teplotních změn, bolesti, svědění, udržování kožní bariéry, hojení ran a růstu vlasů. Poruchy jeho funkce jsou příčinou mnoha závažných lidských kožních chorob, včetně genodermatózy známé jako Olmstedův syndrom, atopické dermatitidy, růžovky i psoriázy. Mezinárodní tým vědců vedených Prof. Alexandrem Sobolevským (Columbia University, New York, NY, USA) ve spolupráci s vědci z Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky v Praze zjistil, jak se mění TRPV3 kanál působením tepla, a určil molekulární podstatu jeho aktivace. Studie prokazuje, že otvírání TRPV3 teplotami překračujícími fyziologický práh (vyššími než 40 °C) zahrnuje změny sekundární struktury specifických oblastí proteinového komplexu kanálu, ale také aktivní účast membránových lipidů. Výsledek je důležitým příspěvkem k pochopení obecných molekulárních mechanizmů teplotní aktivace TRP kanálů a nezbytným předpokladem k vyhledávání možných přístupů jejich farmakologické regulace. O významu výzkumu těchto pozoruhodných bílkovinných komplexů svědčí nedávno udělená Nobelova cena za fyziologii a lékařství 2021, kterou získali dva američtí vědci David Julius a Ardem Patapoutian.

Vlevo: vizualizace přechodu mezi zavřeným a otevřeným stavem TRPV3 iontového kanálu při aktivaci teplem získaná kryoelektronovou mikroskopií. Vpravo, vizualizace přechodů mezi strukturami zavřeného, senzitizovaného a otevřeného stavu TRPV3 kanálu při aktivaci teplem. Dynamické oblasti zodpovědné za změny konformačních stavů jsou vyznačeny růžovou barvou, oblasti s nejvýraznějšími strukturními změnami jsou vyznačeny tmavě rudou barvou.

Nadezhdin, K. D. - Neuberger, A. - Trofimov, Yu. A. - Krylov, N. A. - Sinica, Viktor - Kupko, N. - Vlachová, Viktorie - Zakharian, E. - Efremov, R. G. - Sobolevsky, A. I. Structural mechanism of heat-induced opening of a temperature-sensitive TRP channel. Nature Structural & Molecular Biology. Roč. 28, č. 7 (2021), s. 564-572. ISSN 1545-9993. E-ISSN 1545-9985, IF: 15.369, rok: 2020, DOI

Nové poznatky mohou pomoci zlepšit diagnostické metody u rakoviny prsu (23.8. 2021)

V důsledku onemocnění karcinomem prsu umírá každoročně v Čechách přes 1500 žen. V naší práci jsme se zaměřili na metabolismus 2-hydroxyglutarátu (2HG), onkometabolitu, který připomíná normální buněčný metabolit 2-oxoglutarát (2OG) a jehož akumulace v buňkách může vést k zesílení procesů ve vývoji rakoviny. 2HG je produkt anebo vedlejší produkt několika metabolických enzymů, včetně mitochondriálních. Zkoumali jsme, zda je produkce mitochondriálních 2HG zvýšena v buněčných liniích rakoviny prsu a identifikovali jsme aktivní kompetici o počáteční substrát, 2OG, mezi enzymy isocitrát dehydrogenázou IDH2 a alkohol dehydrogenázou ADHFE1. Také jsme zkoumali roli kofaktoru NADPH mezi dvěma molekulami IDH2 v mitochondriích. Charakterizovali jsme několik situací, kdy IDH2 a ADHFE1 produkují nezanedbatelné množství 2HG aktivně exportovaného z buněk. Hladiny 2HG jsme dále kvantifikovali v moči u skupiny pacientek po odstranění karcinomu prsu. Našli jsme jasnou korelaci mezi hladinami 2HG a stádii nemoci I-IV, jež se liší v množství a lokalizaci případných metastáz. Naše poznatky by mohly v budoucnu zlepšit diagnostické přístupy karcinomu prsu.

Špačková; Jitka - Gotvaldová; Klára - Dvořák; Aleš - Urbančoková; Alexandra - Pospíšilová; K. - Větvička; D. - Leguina-Ruzzi; Alberto A. - Tesařová; P. - Vítek; L. - Ježek; Petr - Smolková; Katarína . Biochemical Background in Mitochondria Affects 2HG Production by IDH2 and ADHFE1 in Breast Carcinoma . Cancers (Basel). 2021; 13(7)); 1709 . IF = 6.639 [ASEP] [ DOI ]

Palmitoylace ovlivňuje citlivost NMDA receptorů k neurosteroidům (3.5. 2021)

N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory patří mezi ionotropní glutamátové receptory, které jsou klíčové pro synaptický přenos a procesy učení a paměti. Jejich nadměrná aktivace ale přispívá ke vzniku závažn‎ých patologick‎ých stavů souvisejících například s mozkovou mrtvicí či Alzheimerovou chorobou. Nadměrná aktivita NMDA receptorů může být inhibována řadou látek, mezi které patří i neurosteroidy.

Za využití elektrofyziologických a molekulárně-biologických technik jsme objasnili molekulární mechanismus, jakým dochází ke zvýšení citlivosti NMDA receptorů k inhibičním neurosteroidům.  Tato změna je vyvolána depalmitoylací tří cysteinů (C849, C854, C871) v intracelulární části receptorové podjednotky GluN2B, po přechodném zvýšení intracelulární koncentrace Ca2+. Mimo farmakologických důsledků vede depalmitoylace receptoru ke změně kinetických parametrů ve prospěch zavřeného stavu. Zvýšená citlivosti NMDA receptorů k inhibičním neurosteroidům je tak dalším z neuroprotektivních mechanismů, které brání excitotoxickému poškození nervové tkáně.

Hubálková, Pavla - Ladislav, Marek - Vyklický, Vojtěch - Smejkalová, Tereza - Hrčka Krausová, Barbora - Kysilov, Bohdan - Krůšek, Jan - Naimová, Žaneta - Kořínek, Miloslav - Chodounská, Hana -Kudová, Eva - Černý, Jiří - Vyklický ml., Ladislav Palmitoylation Controls NMDA Receptor Function and Steroid Sensitivity. Journal of Neuroscience 2021. 41 (10) 2119-2134, F: 5.674 DOI

Hřebíčkový olej tlumí citlivost zubů na chlad působením na iontový kanál TRPC5 (30.4. 2021)

Zubní kaz může způsobit, že je pro nás dotek studeného nápoje utrpením. Mezinárodní tým vědců vedených Prof. Katharinou Zimmermannovou (Friedrich – Alexander University Erlangen – Nürnberg v Německu) ve spolupráci s vědci z Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky v Praze zjistil, jak zuby detekují chlad, a určil molekulární podstatu vzniku dentální bolesti vyvolané chladem. U myší i lidí obsahují zubní buňky zvané odontoblasty speciální chladové senzory, iontové kanály TRPC5, které převádějí informaci o bolestivém podnětu a předávají ji do nervového systému. Studie nabízí vysvětlení, proč hřebíčkový olej, který je po staletí používán ve stomatologii, může zmírnit bolest zubů. Hřebíčkový olej obsahuje chemickou látku eugenol, která blokuje protein TRPC5 a brání mu v aktivaci nervů. Video

Odontoblasty obsahující iontový kanál TRPC5 (zeleně označený) těsně vyplňují oblast mezi zubní dření a zubovinou v myší stoličce. Vláskové výběžky vyplňují tenké kanálky zuboviny směrem ke sklovině. Senzorické neurony jsou označeny červeně (bIII-tubulin). Modře jsou označena buněčná jádra (Hoechst 33258) (Kredit: L. Bernal et al./Science Advances 2021)

Bernal, L. - Sotelo-Hitschfeld, P. - König, Ch. - Sinica, Viktor - Wyatt, A. - Winter, Z. - Hein, A. - Touška, Filip - Reinhardt, S. - Tragl, A. - Kusuda, R. - Wartenberg, P. - Sclaroff, A. - Pfeifer, J. D. -Ectors, F. - Dahl, A. - Freichel, M. - Vlachová, Viktorie - Brauchi, S. - Roza, C. - Boehm, U. - Clapham, D. E. - Lennerz, J. K. - Zimmermann, K. Odontoblast TRPC5 channels signal cold pain in teeth. Science Advances. Roč. 7, č. 13 (2021), č. článku eabf5567. ISSN 2375-2548. IF: 13.117, rok: 2019.  DOI

Nanocelulóza jako perspektivní nosič buněk pro aplikace v regenerativní medicíně (8.4. 2021)

Celulóza ve formě tkaniny je po stovky a tisíce let užívána jako tradiční obvazový materiál. V moderní době však může být využita nejen pro pasivní překrytí ran, ale i pro aktivní hojení ran, např. cílenou dodávkou léčiv i buněk pro regeneraci poškozené tkáně. K tomuto účelu je vhodná zejména nanocelulóza, tj. celulóza v podobě nanovláken či nanofibril, simulující přirozenou architekturu mezibuněčné hmoty. Tato forma celulózy je produkována např. určitými druhy bakterií, či může být izolována z rostlin včetně dřevin. Na experimentální úrovni jsme se soustředili na vytvoření „inteligentních“ krytů ran, schopných dodávat kožní a kmenové buňky do ran na kůži. Tyto materiály jsou založeny na přítomnosti elektricky nabitých nanofibril celulózy, nanesených na mikrovlákennou celulózovou tkaninu. Anionická nanocelulóza v našich buněčných kulturách in vitro představovala vhodný substrát pro adhezi a růst lidských kožních fibroblastů a lidských kmenových buněk tukové tkáně na svém povrchu, kdežto kationická nanocelulóza podporovala spíše adhezi buněk k sobě navzájem a tvorbu kulovitých buněčných shluků, což bylo nápadné zejména u fibroblastů (obr. 1). Rozdíl byl zřejmě způsoben přednostní adsorpcí albuminu ze séra kultivačního média, který je neadhezivní pro buňky, na kationickou nanocelulózu. Obojí typ nanocelulózy však nachází své uplatnění v regenerativní medicíně. Anionická nanocelulóza je vhodná pro vytváření souvislých buněčných vrstev, které se mohou v ráně uchytit buď spontánně, nebo je lze od nanocelulózy oddělit pomocí enzymů celuláz, zatímco kationická nanocelulóza je výhodná pro tvorbu buněčných sféroidů, důležitých struktur pro tvorbu organoidů a pro aplikace v tkáňovém inženýrství.

Obr. 1 Morfologie normálních lidských kožních fibroblastů (NHDFs; A) a lidských kmenových buněk tukové tkáně (ADSCs; B) po 7 dnech kultivace na celulózové tkanině pokryté anionickými (a600) a kationickými (c600) celulózovými nanofibrilami. 3D projekce mikroskopických obrázků buněk na materiálu (čelní a boční náhled). F-aktin buněčného cytoskeletu je obarven červeně, vinculin (protein zúčastněný v adhezi buněk) je obarven zeleně. Konfokální mikroskop, zvětšení objektivu 40x.

Pajorova J, Skogberg A, Hadraba D, Broz A, Travnickova M, Zikmundova M, Honkanen M, Hannula M, Lahtinen P, Tomkova M, Bacakova L, Kallio P. A cellulose mesh with charged nanocellulose coatings as a promising carrier of skin and stem cells for regenerative applications. Biomacromolecules, 2020, 21: 4857-4870, https://dx.doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01097; IF = 6.092; DOI

Antidiabetické lipidy jako substráty neutrálních lipáz (5.1. 2021)

Množství tělesného tuku je řízeno rovnováhou mezi degradací a syntézou triacylglycerolů (TAG). Tuková triglyceridová lipáza (adipose triglyceride lipase, ATGL) a hormon-senzitivní lipáza (HSL) jsou klíčovými hráči v katabolismu TAG a poskytují mastné kyseliny (FA) jako energetické substráty a metabolické meziprodukty. Díky spolupráci s kolegy z Univerity Graz, Université de Montpellier a Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR jsme objevili, že ATGL a HSL metabolizují TAG obsahující antidiabetické lipidové mediátory FAHFA (FA estery hydroxylovaných FA ovlivňující vstup glukózy do buněk), což výrazně reguluje uvolňování bioaktivních lipidů. Náš článek spojuje metabolismus TAG zprostředkovaný lipolýzou s regulací antidiabetických signálních lipidů.

FAHFA vázané na glycerol v TAG, pojmenované TAG estolidy, slouží jako metabolický sklad FAHFA. Zjistili jsme, že samotná ATGL nebo ATGL stimulovaná aktivátorem CGI-58 účinně uvolňovala FAHFA z TAG estolidů s preferencí pro kompaktnější substráty, kde je bod rozvětvení estolidu umístěn poblíž glycerolesterové vazby. ATGL se dále podílela na transesterifikačních a remodelačních reakcích vedoucích k tvorbě TAG estolidů s alternativními acylovými kompozicemi. HSL představovala mnohem účinnější hydrolázu estolidové vazby jak pro TAG estolidy, tak pro volné FAHFA. Akumulace FAHFA a TAG estolidů v bílé tukové tkáni myší bez HSL ukazuje na důležitou roli HSL v katabolismu estolidů in vivo.

K. Brejchova, F.P.W. Radner, L. Balas, V. Paluchova, T. Cajka, H. Chodounska, E. Kudova, M. Schratter, R. Schreiber, T. Durand, R. Zechner, O. Kuda. Distinct roles of adipose triglyceride lipase and hormone-sensitive lipase in the catabolism of triacylglycerol estolides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 118(2) (2021) e2020999118. IF = 9.412 DOI

Mitochondriální kardiolipin v tukové tkáni jako nový cíl pro léčbu srdeční kachexie (7.12. 2020)

Více než polovina úmrtí v České republice je způsobena kardiovaskulárními onemocněními, přičemž většina pacientů trpí srdečním selháním (HF). Dlouhodobá prognóza se zhoršuje kachexií, která se rozvíjí u části těchto nemocných. Účinná léčba kachexie však zatím neexistuje. Ve spolupráci vědců z Institutu klinické a experimentální medicíny a Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky v Praze byla provedena studie u pacientů s HF, kteří podstoupili transplantaci srdce (n = 52). V tukové tkáni lokalizované v okolí srdce pacientů s kachexií jsme prokázali (i) výrazné uvolňování mastných kyselin (FA) vlivem neurohumorální stimulace a (ii) syntézu neobvyklého fosfolipidu kardiolipinu (CL 70:6). Tento fosfolipid může zhoršovat mitochondriální funkce v tukových buňkách a umocňovat tak kachektizaci tkáně. Mohl by představovat nový léčebný cíl při kachexii.

U pacientů se srdečním selháním dochází vlivem natriuretických peptidů (NP), sympatického nervového systému (SNS) a renin-angiotensin-aldosteronového systému (RAAS) ke stimulaci lipolytického štěpení triacylglycerolů (TAG) v tukové tkáni. Tím je zvýšeno uvolňování FA a glycerolu do cirkulace. U pacientů se stabilní tělesnou hmotností je štěpení TAG v rovnováze s jejich syntézou, která závisí na glyceroneogenezi, de novo syntéze FA (DNL) a FA re-esterifikaci. Tyto reakce potřebují ATP, které je syntetizováno oxidační fosforylací (OXPHOS) spojenou s β-oxidací FA v mitochondriích. Patologické zvýšení lipolýzy u pacientů s kachexií je spojeno se syntézou kardiolipinu CL 70:6 v tukové tkáni. Tento lipid indukuje odpřažení OXPHOS a tím inhibuje syntézu ATP. Výsledkem je nedostatečná obnova TAG v adipocytech a úbytek tukové tkáně.

Janovska P, Melenovsky V, Svobodova M, Havlenova T, Kratochvilova H, Haluzik M, Hoskova E, Pelikanova T, Kautzner J, Monzo L, Jurcova I, Adamcova K, Lenkova L, Buresova J, Rossmeisl M, Kuda O, Cajka T, Kopecky J. Dysregulation of epicardial adipose tissue in cachexia due to heart failure: the role of natriuretic peptides and cardiolipin. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 2020; IF: 9.802 DOI

Neurosteroid pregnenolon sulfát - odhalení místa jeho působení na N-methyl-D-aspartátový receptor (26.10. 2020)

NMDA receptory jsou iontové kanály podílející se na přenosu elektrického signálu mezi nervovými buňkami. Jejich snížená funkce přispívá k řadě závažných neuropsychiatrických onemocnění, jako například ke schizofrenii, či autismu. Aktivita NMDA receptorů může být zvýšena prostřednictvím nejrůznějších látek včetně neurosteroidů.  Ve spolupráci s Ústavem organické chemie a biochemie AV ČRse nám podařilo odhalit vazebné místo a objasnit mechanismus působení pro přirozeně se vyskytující neurosteroid pregnenolon sulfát (PES). PES se váže na rozhraní membránových domén NMDA receptoru v zavřeném stavu, což po následné aktivaci receptoru pomocí glutamátu vede k přeuspořádání membránových domén a stabilizaci otevřeného stavu iontového kanálu NMDA receptoru. Dané poznatky mohou přispět k vývoji nových látek pro léčbu onemocnění spojených s nedostatečnou funkcí glutamátergního systému.

Interakce molekuly PES (zeleně) s membránovými doménami NMDA receptoru v otevřeném stavu získaná dokováním následovaným molekulárně-dynamickou simulací. Aminokyseliny zapojené do interakce s molekulou PES jsou vyznačeny červeně.

Hrčka Krausová B, Kysilov B, Černý J, Vyklický V, Smejkalová T, Ladislav M, Balík A, Kořínek M, Chodounská H, Kudová E, Vyklický ml. L. Site of Action of Brain Neurosteroid Pregnenolone Sulfate at the N-Methyl-D-Aspartate Receptor. Journal of Neuroscience. 2020; 40 (31) 5922-5936. IF: 5.673 DOI

Dietní suplementace olejem z Krilu jako nová strategie ke zlepšení citlivosti organismu k inzulínu a snížení akumulace tuku v játrech při obezitě (20.10. 2020)

Změna životního stylu zahrnující i zdravou výživu představuje důležitou součást strategie prevence i léčby negativních metabolických důsledků obezity. Olej z Krilu jako extrakt z antarktického krilu Euphausia superba (tj. korýšů vyskytujících se v antarktických vodách) je relativně novým zdrojem omega-3 polynenasycených mastných kyselin (Omega-3). Bylo prokázáno, že doplňky stravy obsahující Omega-3, obvykle podávané ve formě koncentrátu na bázi triacylglycerolů nebo ethylesterů, mohou snížit zánět a nadměrné ukládání tuku v játrech (tj. jaterní steatózu).

U obézních pacientů s diabetem 2. typu však podávání těchto forem Omega-3 nemusí nutně vést ke zlepšení citlivosti organismu k inzulínu, a navíc může zhoršit dlouhodobou kontrolu metabolismu glukózy. Proto jsme na obézních myších testovali, zda podání Omega-3 navázaných na jiný lipidový nosič, v tomto případě na fosfolipidy v krilovém oleji, může mít příznivé metabolické účinky a zároveň zlepšit metabolismus glukózy a citlivost organismu k inzulínu.

Naše studie prokázaly, že suplementace krillovým olejem dokáže snížit steatózu jater více než Omega-3 podávané ve formě triacylglycerolů, a tento účinek krillového oleje byl doprovázen zlepšenou inzulínovou citlivostí na úrovni jater i celého těla. Příznivý účinek krilového oleje na glukózovou homeostázu byl spojen nejen se zlepšenou biologickou dostupností Omega-3 (např. EPA, n-3 DPA) ve tkáních, ale také s cirkulujícími hladinami kyseliny palmitolejové, již dříve identifikovaného lipokinu (tj. hormonu lipidové povahy) s inzulín-senzitizujícími vlastnostmi, jehož obsah je v krilovém oleji zvýšen. Kromě toho olej z krilu účinněji než Omega-3 na bázi triacylglycerolů indukoval katabolismus mastných kyselin v tenkém střevě. Tento proces by tak mohl přispívat k silnému antisteatotickému účinku krilového oleje. Naše výsledky poskytují obecné zdůvodnění pro použití fosfolipidů s obsahem Omega-3 jako doplňků výživy se silnými inzulín-senzitizujícími a antisteatotickými účinky.

Samci C57BL/6N myší byli krmeni po dobu 8 týdnů dietou s vysokým obsahem tuku na bázi kukuřičného oleje (cHF) nebo doplněnou koncentrátem Omega-3 obsažených v triacylglycerolech (cHF+ω3TG) nebo fosfolipidech z krilového oleje (cHF+ω3PL); štíhlé kontroly byly krmeny nízkotučnou standardní dietou (A). Podávání cHF zhoršilo citlivost k inzulínu (stanoveno měřením rychlosti infůze glukózy během hyperinzulinemické-euglykemické svorky;  B – nahoře) a způsobilo výraznou akumulaci lipidů v játrech (tj. steatózu jater;  B – dole). Zatímco u cHF+ω3PL myší byla citlivost k inzulínu téměř zachována a jaterní steatóza prakticky eliminována, u cHF+ω3TG myší byly pozorovány mnohem méně výrazné účinky. Příznivé metabolické změny pozorované po podání krillového oleje mohou souviset se zvýšenými hladinami inzulín-senzitizujícího lipokinu palmitoleátu (POA) v cirkulaci (C – nahoře) a zvýšeným katabolismem mastných kyselin přímo ve střevní tkáni (C – dole).

Rossmeisl M, Pavlisova J, Bardova K, Kalendova V, Buresova J, Kuda O, Kroupova P, Stankova B, Tvrzicka E, Fiserova E, Horakova O, Kopecky J. Increased plasma levels of palmitoleic acid may contribute to beneficial effects of Krill oil on glucose homeostasis in dietary obese mice. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2020;1865(8):158732. IF: 4.519 DOI

Kroupova P, van Schothorst EM, Keijer J, Bunschoten A, Vodicka M, Irodenko I, Oseeva M, Zacek P, Kopecky J, Rossmeisl M, Horakova O. Omega-3 Phospholipids from Krill Oil Enhance Intestinal Fatty Acid Oxidation More Effectively than Omega-3 Triacylglycerols in High-Fat Diet-Fed Obese Mice. Nutrients. 2020;12(7):2037. IF: 4.546 DOI