Draselné kationty jsou klíčové pro mnoho fyziologických procesů (např. pro kompenzaci negativního náboje makromolekul, regulaci vnitrobuněčného pH, membránového potenciálu nebo buněčného objemu). Naopak zvýšené hladiny ostatních kationtů alkalických kovů (Li⁺, Na⁺, Rb⁺) jsou pro buňky toxické. Pro udržení optimální koncentrace kationtů v cytosolu využívají buňky celou řadu transportních systémů, jejichž dokonalá souhra zajišťuje buňce stálé vnitřní prostředí nezbytné pro udržení života.

Nejznámějším modelovým organismem eukaryotních buněk je kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Dokáže přežívat v prostředí s variabilním pH (definovaném koncentrací kationtů H⁺) a tolerovat široký rozsah koncentrací K⁺ a Na⁺. V cytosolu buněk však musí být homeostáze těchto kationtů přesně regulována. K tomu v kvasince slouží více než deset různých transportérů pro kationty K⁺, Na⁺ a H⁺ lokalizovaných v plasmatické membráně (zajišťují vstup a výstup kationtů z buněk) nebo v membránách vnitrobuněčných organel (podílí se na transportu kationtů mezi cytosolem a buněčnými organelami). Charakterizací jednotlivých transportérů se snažíme pochopit, jak se eukaryotní buňky přizpůsobují neustálým změnám hladin iontů ve vnějším prostředí.

Transportní systémy pro K⁺ a Na⁺ v kvasince S. cerevisiae (červenou hvězdičkou jsou označeny transportní systémy, na jejichž charakterizaci jsme se podíleli).

 

Geny pro jednotlivé transportéry mohou být v buňkách S. cerevisiae deletovány. Naše laboratoř vlastní obsáhlou sbírku kmenů s delecemi jednotlivých transportních systémů nebo s kombinacemi delecí. Kmeny kvasinek postrádající vlastní transportní systémy slouží k heterologní expresi a studiu transportních systémů z vyšších organismů (rostlin, živočichů i člověka).

 

U jednotlivých transportérů nás zajímá:

 

1. Lokalizace

Studované proteiny značíme fluorescenčními značkami a pozorujeme buňky syntetizující tyto proteiny ve fluorescenčním mikroskopu.    

Nha1-GFP v plasmatické membráně (Kinclová et al., 2001)			Vhc1-GFP ve vakuolární membráně (Petrezselyová et al., 2013)	Kha1-GFP v Golgiho aparátu (Marešová et al., 2006)	Lidský GFP-NHA2 v plasmatické membráně S. cerevisiae (Velazquez et al. 2022)

Příklady lokalizace transportérů v kvasince S. cerevisiae

 

2. Struktura

Pomocí mutageneze hledáme aminokyselinové zbytky důležité pro fungování transportéru.

Strukturní (3D) model transmembránové oblasti Na⁺/H⁺ antiportního systému Sod2-22 z kvasinky Z. rouxii  vytvořený na základě podobnosti s  antiporterem NhaA z bakterie Escherichia coli (Kinclova-Zimmermannova et al., 2015). (a) Celkový pohled z boku. Vyznačeny jsou aminokyselinové zbytky Thr141, Ala179, Phe180 and Val375 důležité pro substrátovou specifitu transportéru (b) Detailní pohled na hydrofobní filtr důležitý pro určení substrátové specifity antiporterů Na⁺/H⁺ kvasinek. Pohled na TMS 2, 4, 5 a 11 v modelu 3D shora. Pravděpodobné vazebné místo pro kationty (Asp176) je umístěno za hydrofobním filtrem. 

 

Charakterizace rodiny antiporterů Nha/Sod lokalizovaných v plasmatické membráně kvasinek.

Do rodiny antiporterů Na⁺/H⁺ plasmatické membrány v eukaryotních buňkách patří přenašeče, které transportují všechny kationty alkalických kovů (Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺), ale také systémy, jež rozpoznávají pouze Li⁺ a Na⁺ (Kinclová et al, 2002). Identifikovali jsme  aminokyselinové zbytky důležité pro rozpoznání, vazbu a transport kationtů u antiporterů v plasmatické membráně kvasinek (S. cerevisiae Nha1, Zygosaccharomyces rouxii  Sod2-22) (Kinclova-Zimmermannova et al., 2005; 2006; 2015; Albacar et al. 2021) i u lidského antiporteru NHA2 (Vélazquez et al. 2022). Vytvořili jsme 3D-model transmembránové oblasti proteinu Sod2-22 a zjistili jsme, že aminokyseliny idetifikované pomocí mutageneze tvoří v centrální části proteinu hydrofobní filtr důležitý pro určení substrátové specifity antiporterů Na⁺/H⁺ (Kinclová-Zimmermannová et al., 2015). V současné době hledáme další důležité oblasti proteinů určující substrátovou specifitu a transportní aktivitu v antiporterech Na⁺/H⁺ i dalších transportérech.

Na+/H+ antiportní systém NHA2 zastává v lidských buňkách řadu fyziologických funkcí a narušení jeho aktivity vede k řadě patologií, od metabolických poruch až po neplodnost. a) Topologický model struktury NHA2 s 14ti transmembránovými doménami. Vyznačeny jsou důležité regulační oblasti a jejich význam pro funkci transportéru, které jsme identifikovali pomocí heterologní exprese NHA2 v kvasince S. cerevisiae b) Model vazby specifického inhibitoru NHA2 phloretinu. Odhalili jsme, že phloretin se váže blízko vazebného místa pro kationty (D279). Modifikace Pro246 na polární aminokyselinu treonin nebo serin snížila inhibiční účinek phloretinu (Vélazquez et al. 2022).

 

3. Transportní vlastnosti

Určujeme substrátovou specifitu a transportní aktivitu transportérů.

Fylogenetický strom ukazuje příbuznost kvasinkových Na⁺/H⁺ antiporterů plasmatické membrány, na jejichž charakterizaci se podílela naše laboratoř. Modře jsou označeny antiportery rozpoznávající jako substrát výhradně nebo s výrazně vyšší afinitou kationty Na⁺ a Li⁺ a sloužící tak kvasinkám především pro odstraňování toxických kationtů z buněk. Červeně označené proteiny exportují z buněk také draselné kationty a jejich úloha ve fyziologii buněk je komplexnější – podílí se na regulaci buněčného obsahu K⁺, vnitrobuněčného pH a objemu buněk.

 

4. Regulace aktivity

Jednotlivé transportní systémy mohou být regulovány na úrovni exprese genu, biogeneze daného proteinu či interakce s jinými proteiny. Odhalili jsme řadu nových regulačních mechanismů, které se podílejí na udržování homeostáze kationtů a pH v eukaryotních buňkách, např. na úrovni biogeneze transportérů (Rosas-Santiago et al., 2015, 2016; 2017; Zimmermannova et al. 2019), pomocí vzájemného propojení mezi transportéry protonů, draselných a/nebo vápenatých kationtů (Zimmermannova at al., 2015; Papouskova et al., 2015; Zimmermannová et al. 2021) nebo prostřednictvím lipidového složení buněčných membrán (Kodedová at al., 2015). Zjistili jsme, že na regulaci transportérů kationtů v S. cerevisiae se podílejí také regulační proteiny 14-3-3 (Smidova et al. 2019) nebo fosfatáza Ppz1 (Albacar et al. 2021). 

 

Biogeneze draselných transportérů Trk1, Tok1 a Nha1 je závislá na přítomnosti cargo receptoru Erv14/cornichon. Delece genu ERV14 vede v buňkách S. cerevisiae k zadržování těchto proteinů v endoplasmatickém retikulu. Naopak cesta draselných transportérů Trk2 a Ena1, nebo exportéru H⁺ Pma1 z endoplasmatického retikula do plasmatické membrány je na přítomnosti Erv14 nezávislá(Rosas-Santiago et al. 2016, Zimmermannova et al. 2019). V lidských buňkách existují čtyři isoformy genu ERV14 ,  CNIH1-4. V současné době studujeme vlastnosti proteinů CNIH, jejich schopnost komplementovat funkci kvasinkového homologu a jejich vliv na biogenezi lidských i kvasinkových transportérů.