Rostlinné, živočišné, bakteriální i virové genomy lze třídit podle různých hledisek – např. podle typu molekuly, z níž se skládají, rozdělujeme genomy na tvořené DNA nebo RNA; podle složitosti odlišujeme genomy jednoduché a komplexní; podle typu uspořádání genomových molekul mluvíme o genomech cirkulárních a lineárních. Cirkulární genomy jsou tvořeny DNA či RNA, která se podobá kružnici. Nejjednodušším způsobem, jak se cirkulární genom kopíruje, je kopírování z určitého místa počátku, podél celého řetězce dokola, přičemž první a poslední zkopírovaný nukleotid se kovalentně spojí a tím se úspěšně a kompletně uzavře nově vzniklá kružnice. Cirkulární genomy, v porovnání s lineárními, patří spíše mezi malé a méně složité. Není výjimkou, že celý bakteriální či virový cirkulární genom může být tvořen jedinou molekulou. U lineárních genomů sledujeme v tomto směru nárůst složitosti. Kompletní lineární genom rostlin a živočichů bývá nejčastěji tvořen mnoha různými molekulami – chromozomy (počet chromozomů 2n řádově v jednotkách a desítkách, ale výjimečně i tisících chromozomů). Oproti cirkulárním genomům musely lineární genomy vyřešit dva základní problémy své existence. Jak konce svých lineárních molekul úspěšně celé kopírovat, aby se nezkracovaly a jak je uchovat před nepříznivými vlivy a nechtěným spojováním. Ochrannou funkci zastávají bílkoviny navázané na koncové sekvence. Složené struktury bílkovin a nukleových kyselin na koncích chromozomů nazýváme telomery. Jejich délku, např. u savců a rostlin, udržuje enzym nazvaný telomeráza, ale ve skutečnosti existuje ještě řada dalších cest a prostředků, kterými lze žádaného výsledku dosáhnout – těmto mechanismům je věnován první díl článku.
Doporučená literatura:
PEŠKA, Vratislav, et al. Characterisation of an unusual telomere motif (TTTTTTAGGG) n in the plant Cestrum elegans (Solanaceae), a species with a large genome. The Plant Journal, 2015, 82.4: 644-654.
SÝKOROVÁ, Eva, et al. The absence of Arabidopsis‐type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae): first evidence from eudicots. The Plant Journal, 2003, 34.3: 283-291.
SÝKOROVÁ, Eva, et al. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 2003, 270.1527: 1893-1904.
Plant, animal, bacterial and even viral genomes can be classified on the basis of various criteria, e. g. with respect to their biochemical characteristics there are DNA vs. RNA genomes; based on their complexity they can be divided into groups containing genomes with low and high complexity; finally, considering their arrangement we talk about circular and linear genomes. Circular genomes are formed by DNA or RNA that resembles a circle. The simplest way to replicate a circular genome is to start its amplification from a specific locus of origin and to continue along around the whole strand, until the very first and the very last nucleotide are covalently bound and so the circle is completely finished. Circular genomes are generally less complex and smaller than the linear ones. It is not an exception that the whole bacterial or viral genome is represented by a single molecule. Increased complexity is observed when linear genomes are studied. Plant and animal genomes are usually formed by many different molecules – chromosomes (generally, 2n is a number in units, tens and even thousands of chromosomes). In contrast to circular genomes, the linear ones have to overcome two basic problems in their existence – how to replicate their ends and how to protect them. The protection is ensured by nucleoprotein complexes. In plants and mammals, the replication and maintenance of chromosome ends is provided by an enzyme called telomerase, but there are many different ways and possibilities to solve the end replication problem. This article focuses on various mechanisms that are capable of maintaining the chromosome ends in linear genomes.
-
Jihoamerický keř kladivník Cestrum elegans. Dlouhou dobu byl mezi dvouděložnými rostlinami spolu s jeho dvěma blízce příbuznými rody z čeledi lilkovitých (Solanaceae) – Vestia a Sessea – jedinou známou výjimkou, u které jsme nevěděli, jaká sekvence tvoří jeho telomery a zda ji udržuje telomeráza. Foto M. Studnička
-
Detail květů česneku ozdobného (Allium cristophii) – středoasijského, u nás ale často pěstovaného druhu. Mezi jednoděložnými jsme od r. 1995 věděli o neznámých telomerách v rodu Allium. Tento hospodářsky významný rod se stovkami druhů patří do řádu chřestotvarých (Asparagales – zajímavý ještě tím, že zahrnuje zástupce s klasickými rostlinnými telomerami a telomerami se sekvencí vyskytující se u člověka – např. Aloe spp.). Foto V. Motyčka
-
Chromozomy kladivníku Cestrum elegans se signály telomerové sondy TTTTTTAGGG. Na obr. vidíme výsledek fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Mitotické chromozomy jsou připraveny z roztlaku kořenových špiček na podložním skle a obarveny pomocí fluorescenční barvy specifické pro veškerou DNA (červený signál). Nezávisle na tom je telomerová sekvence zmnožena a označena ve zkumavce pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a např. zeleně fluoreskující značky. Při aplikaci takto připravené telomerové sondy na roztlaky dochází za určitých podmínek (teplota, koncentrace solí, pH atd.) k sekvenčně specifické interakci mezi sondou a chromozomy. Sonda tak označí komplementární úseky a zůstane na nich navázaná. V mikroskopu pak můžeme pozorovat místa na chromozomech, kde se sonda váže, tedy kde se nachází daná sekvence. Foto V. Peška
-
Replikace DNA. Mateřské řetězce (a, černě) jsou uspořádány antiparalelně. V místě počátku replikace se oddělují (b) a vzniká místo pro nasedání prvních RNA primerů (modře). Replikace, tedy vznik antiparalelních dceřiných řetězců (c, červeně), probíhá na každém mateřském řetězci DNA v jednom směru. Pokud se nový řetězec prodlužuje po směru syntézy od 5′ k 3′ konci (např. horní červené vlákno směrem vlevo), probíhá vše spojitě z prvního RNA primeru. Jestliže se nová DNA prodlužuje v opačném směru (např. dolní červené fragmenty směrem vpravo), proces je nespojitý (pokračuje přerušovaně), protože polymeráza dokáže prodlužovat jen 3′ konec, a tudíž je nutné nasedání nových RNA primerů s tím, jak se replikační bublina rozšiřuje. Nakonec se replikace dostane k oběma koncům (d), téměř celá molekula je semikonzervativním způsobem replikována (výsledně novou molekulu tvoří jedno nové – dceřiné a jedno staré – mateřské vlákno). Zbývá odbourat RNA primery a nahradit je úseky DNA (e), a to vždy od 3′ konce již nasyntetizovaného fragmentu DNA. Nakonec se části nových řetězců syntézou spojí (f), ale nový řetězec je zkrácen na 5′ konci, protože zde DNA polymeráza neměla k dispozici žádný primer. Toto zkrácení může být kompenzováno telomerázou (g, žlutě), která prodlouží 3′ konec templátu podle vlastní RNA předlohy (zakřivená modrá šipka). Tím vzniká přesah pro nasedání dalších RNA primerů (h). Úplný konec molekuly DNA sice opět není tvořen dvěma řetězci, ale celkově byla lineární DNA prodloužena a neztratila žádnou informaci (i). Orig. V. Peška
-
Terminální protein – proteinový priming u bakteriofága Φ29. Fágem kódovaná DNA polymeráza (Pol) se účastní vytváření kovalentní vazby (a) mezi prvním nukleotidem (dAMP) a serinem 232 koncového proteinu (TP). Proteinový komplex s dAMP specificky váže thymin na druhé pozici 3′ konce templátové virové DNA (b). Potom se takto vytvořený primer posune na první pozici 3′ konce templátové virové DNA, kde se rovněž nachází thymin, aby byla zachována informace na úplném konci 3′ templátu. DNA polymeráza pak kopíruje celý templátový řetězec z tohoto nukleoproteinového primeru (c) a přibližně po 6 vložených nukleotidech se z TP uvolňuje. Primer-proteinová iniciace replikace probíhá na koncích obou řetězců DNA. Ve chvíli, kdy se polymerázy potkávají, dochází k oddělení dceřiných molekul dvouřetězcové DNA (double-stranded, dsDNA), obou replikovaných syntézou vedoucího řetězce. Výsledkem jsou lineární dsDNA s TP kovalentně vázaným na 5′ koncích. Telomery Φ29 mají tupé konce o sekvenci 5′-TACTTT-3′. Stejný princip udržování konců DNA je pravděpodobně využíván u telomer chromozomů a plazmidů aktinomycet, ačkoli celý proces zde není prostudován tak detailně jako u fága Φ29. Další modely vysvětlující přítomnost TP a palindromických sekvencí (příkladem velmi krátkého palindromu je sekvence TTAA – komplementární vlákno, které když se čte z druhé strany ve směru 5′–3′, dává opět TTAA) byly navrženy ještě u plazmidu pSLA2 izolovaného z bakterie Streptomyces lividans. Orig. V. Peška
-
Schéma různého uspořádání telomerových sekvencí u lineárních mitochondriálních molekul DNA. Červené šipky vymezují jednotky telomerových repetic a jejich 5′–3′ směr v lineárním mitochondriálním genomu, který je naznačen černou barvou. Velikost červených šipek a černých úseků neodpovídá reálnému poměru telomerové DNA vůči zbytku genomu. Podle typu uspořádání lze telomerovou mtDNA rozdělit do 6 variant. U trepky luční (Paramecium aurelia, a) jeden z konců tvoří kovalentně uzavřená jednořetězcová (single-stranded), tedy ssDNA smyčka, ale druhý konec molekuly je otevřený s neznámým mechanismem udržování délky. U nálevníků rodu vejcovka (Tetrahymena, b) byly nalezeny tandemově uspořádané koncové repetice se základní jednotkou o velikosti 31–53 párů bází (bp) a jako hlavní mechanismus udržování délky koncové DNA jsou zde předpokládány rekombinační události. Zelená řasa Chlamydomonas reinhardtii (c) má na koncích mtDNA unikátní strukturu s 3′ přesahy, jež neumožňují recirkularizaci, protože nejsou komplementární. Tato mtDNA nese ještě interní kopii koncových sekvencí, nejspíš klíčovou pro obnovování délky konců při replikaci. Další tři varianty lineární mtDNA byly popsány hlavně u kvasinek. Jako kvasinkový lineární typ I (d) nalezený u rodů Pichia a Williopsis označujeme obrácené terminální repetice s kovalentně uzavřenou vlásenkovou smyčkou, podobnou poxvirové DNA, chromozomům borelií a kvasinkovým typům ze skupiny II. Kvasinkový lineární typ II (e) je tvořen obrácenými koncovými repeticemi, které se skládají z tandemově uspořádaných subrepetic s dlouhou základní jednotkou (např. 738 bp u Candida parapsilosis), včetně 5′ ssDNA přesahů a struktury připomínající telomerickou smyčku (t-smyčku), umožňující amplifikaci DNA otáčivou kružnicí; t-smyčka (viz Živa 2002, 6: 245–248) je lasovitá struktura na konci telomer, která vzniká zanořením jednořetězcového přesahu do dvouřetězcové oblasti. Kvasinkový lineární typ III (f) je reprezentován mtDNA plazmidem pPK2 u Pichia kluyveri, jenž nese na 5′ koncích kovalentně navázaný TP a podobá se tak adenovirové DNA, lineárním chromozomům streptomycet a fágu Φ29. Podobně je tomu u mitochondriálních plazmidů S1 a S2 kukuřice seté (Zea mays), které se vyznačují lineární dsDNA a nesou kovalentně navázané TP. Orig. V. Peška
-
Aloe pulcherrima – endemit střední a severní části Etiopie, kde roste na čedičových skalách a strmých svazích s nezapojenou vegetací. Lalibela v severní Etiopii (2 995 m n. m.). Aloe patří k zástupcům řádu chřestotvarých, u nichž byla nalezena lidská telomerová sekvence (viz také text k obr. 2). Tato skutečnost ale nemá nejspíše žádnou souvislost s blahodárnými účinky jejích extraktů používaných v kosmetice a léčitelství. Foto A. Horáček
-
Detailní pohled na část kolonie divokého kmene kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Divoké kmeny této kvasinky se od těch laboratorních tvořících hladké kolonie liší mimo jiné přítomností extracelulární mezibuněčné hmoty, ale i různou expresí řady genů. Zdá se, že část těchto genů je regulována strukturou chromatinu v blízkosti telomer. Foto M. Kuthan