Vědecká činnost centra Studia Rudolphina se zaměřuje na osobnost Rudolfa II. jako sběratele a mecenáše a na umění a kulturu s ním spojenou, tj. zejména na císařské sbírky a dvorské umělce, ale i na další umělecká odvětví. Úkolem centra je podporovat výzkum uvedených témat u odborné veřejnosti a poskytovat zázemí českým i zahraničním studentům (krátkodobé Stipendium Kateřiny Duškové je udělováno podle možností). Badatelům nabízíme specializovanou příruční knihovnu, některé digitální nástroje a možnost osobní konzultace. Jednou ročně centrum publikuje mezinárodní recenzovaný bulletin Studia Rudolphina, který je indexován v databázi Scopus. Rudolfinským badatelům umožňujeme prezentaci v rámci ústavního cyklu přednášek Collegium Historiae Artium.
Centrum bylo založeno v roce 2000, nicméně navazuje na soustavně prováděný výzkum rudolfínského umění, započatý na půdě ÚDU AVČR v šedesátých letech. Jeho prvním mezinárodním úspěchem bylo vytvoření stálé expozice obrazárny z majetku Pražského hradu a s ní spojená mezinárodní konference (1965). Pracovníci ÚDU se podíleli na přípravě dalších stěžejních výstav s touto tematikou (1988 Essen a 1997 Praha) a zorganizovali řadu specializovaných mezinárodních konferencí. Z poslední doby lze připomenout jejich spolupráci na výstavě Hans von Aachen (1552–1615): Malíř na evropských dvorech (Cáchy, Praha, Vídeň, 2010). U této příležitosti byla zorganizována mezinárodní konference Hans von Aachen and new research in the transfer of artistic ideas into Central Europe, jejímž výstupem se stal sborník Hans von Aachen in Context (2012). Do činnosti centra spadá rovněž mapování kulturních vazeb panovnických dvorů ve střední Evropě. Těm byly zatím věnovány dvě konference a specializované přílohy bulletinu, tj. München – Prag um 1600 (2007) a Dresden – Prag um 1600 (2017). Cílená pozornost je věnována také významu Rudolfa II. pro rozvoj novověké vědy, viz např. publikace Alchymie a Rudolf II. (2011, angl. verze 2017). Mezi oblasti zájmu členů centra patří i bezprostřední předchůdci císaře Rudolfa II., v poslední době zejména arcivévoda Ferdinand II. Habsburský. Výstava jemu věnovaná se uskutečnila v letech 2017–18 v Innsbrucku a v Praze za spolupráce ÚDU, Schloss Ambras Innsbruck a NG Praha. Výzkum kulturních aktivit arcivévody byl podpořen několika granty, které vyústily do knižního zpracování (Knihovna arcivévody Ferdinanda Tyrolského, 2015; monografie o letohrádku Hvězda, 2014, a angl. verze 2017).
V současné době pracuje tým centra Studia Rudolphina na grantu GAČR č. 20-15927S (2020–2022) Umění na odiv: obrazová sbírka císaře Rudolfa II. v kontextu uměleckého sběratelství kolem roku 1600. Projekt se věnuje studiu a interpretaci inventářů zaznamenávajících císařovu obrazovou kolekci, stejně jako otázce rozmístění sbírky v prostorech Pražského hradu. Dokončuje také výstup předchozího grantového úkolu, knihu Archduke Ferdinand II of Austria: A Second-born Son in Renaissance Europe, která bude v roce 2021 publikována v rakouském nakladatelství Verlag der Österreichischen Akademie der Wissenschaften.
