Contacts

Group head: 

Karel J. Angelis

Centre: 

Karlovka

Address: 

Na Karlovce 1a, 160 00 Praha 6

Email: 

angelisueb [dot] cas [dot] cz

Phone: 

+420 224 322 603, +420 224 317 189

www: 

Laboratory of DNA repair

The Group od DNA Repair belong to Laboratory of Pollen Biology
1.              Poškození a reparace DNA.

Skupina se zabývá studiem procesů, které vedou k indukci mutací, reparaci a rekombinaci DNA vlivem působením chemických a fyzikálních genotoxinů. Poškození a reparace DNA je studována na úrovní genomové (jaderné) DNA pomocí elektroforézy DNA jednotlivých buněk, tzv. kometovým testem. Podle podmínek provádění kometového testu je možné detekovat různé druhy poškození jako jedno a dvojvláknové zlomy DNA, alkali labilní léze, oxidační poškození, pyrimidinové dimery vznikající po působení UV a křížové vazby mezi DNA a proteiny a nebo přímo ve šroubovici DNA. Kometovým testem je studována kinetika reparace dvojvláknových zlomů DNA (DSBs) jako markeru homologní rekombinace (HR) nebo na homologii nezávislého spojování konců (NHEJ) a u reparačních T-DNA knock-out mutant Arabidopsis (např. atmim, atlig1, atlig4, atku80, atrad21.1, atbru1 a dalších) a knock-out mutant mechu Physcomitella patens (např. pprad51A,B, pprad50, ppmre11, pnbs1 a dalších). 

a. Reparace DSBs indukovaných cytostatikem a radiomimetikem Bleomycinem s podobným spektrem poškození DNA jako ionizující záření u Arabidopsis, Physcomitrella ale také v lidských buňkách je velmi rychlá a více než 50% indukovaných DSBs je opraveno během 10 minut.

b. Nově byla identifikovaná dráha rychlé reparace DSBs, která závisí na komplexech proteinů udržujících strukturu chromosomů SMC1/3 (studovaný kleisin RAD21.1) a SMC5/6 (studovaný MIM, SMC6b). Jde pravděpodobně o dráhu nezávislou na NHEJ, protože u atku70/80 a atlLig4 mutant je reparace DSBs rychlejší než u nemutovaného standardního typu. Klíčovou roli v této dráze má LIG1, která zároveň u rostlin nahrazuje chybějící LIG3 při reparaci poškozených bazí (BER). 

2. Pěstování molekul bioaktivních proteinů.

Dva rozdílné rostlinné systémy jsou využívány pro expresi a produkci bioaktivních proteinů s potenciálně terapeutickým účinkem.

a. Pomocí širokospektrého rostlinného expresního vektoru odvozeného od TRV viru je v listech Benthamiana tabacum tranzientně produkován protein L1 kapsidy lidského papilloma viru HPV16, který je etiologicky spojován s rakovinou děložního čípku. L1 se spontánně asociuje v pseudovirionové kapsidy, které jsou silný imunogen indukující cytotoxickou reakci a schopné neutralizovat infekci HPV (podmínky profylaktického využití). Imunizací myší hrubým extraktem listů produkujících L1 byla získána monoklonální protilátka E2 specifická k 3D struktuře pseudovirionů. Mab E2 bude dale testována na možné využití při detekci rakoviny děložního čípku.

b. Jako součást cíleného terapeutika pro léčbu leukémií a non-Hodkinových lymfómů exprimujeme rekombinantní monoklonální jednořetězcová protilátka (scFv) odvozená z klonu MEM97 proti povrchovému antigenu CD20. Pro kontinuální produkci antiCD20 scFv byly nejdříve tranzientně optimalizovány expresní kazety antiCD20 v řídících sekvencích, délce linkerů, počtu a umístění glykosylačních mist a použitých reportérových a izolačních značek. Biolistickou transformací mechu Physcomitrella patens byly získány transgenní linie pro produkci rekombinantní antiCD20 scFv v kapalné kultuře. Týdenní produkce v bioreaktorech je 1 mg afinitně čištěné antiCD20 scFv z 10 l kapalné kultury. Produkovaná scFv má při detekci CD20 v krvi pacientů vyšší aktivitu než původní klon MEM97.

c. Na poznatky z optimalizace antiCD20 scFv navazuje vývoj multimerních rekombinantních protilátek pro přímé diagnostické účely. Jde o fúzi lehké (VL) a těžké (VH) variabilní oblasti tvořící vazebné místo s proteiny vytvářejícími multimery. Fúze variabilních oblastí antiCD20 s konstantní část lehkého řetězce IgG (proteinu k) vede k funkčním “diabodies” a fúze s DsRed k fukčním “tetrabodies”.