Druhá část výletu na konec genomu se zaměřuje na objevy telomerových sekvenčních motivů. Jsou zde popsány principy klonování použité při hledání telomerové DNA u specifických taxonů s mírným důrazem na informace ohledně rostlinných telomer. Obvykle jsou telomery udržovány pomocí enzymu – telomerázy. Na druhou stranu známe rostoucí počet výjimek s netelomerázovým prodlužováním telomer, jako jsou např. retrotranspozony dvoukřídlého hmyzu. V tomto směru je překvapující, že i poslední kandidát na netelomerázový systém u vyšších rostlin – rod česnek (Allium) – má rovněž funkční telomerázu, která produkuje minisatelitní motivy. Zdá se tedy, že na rozdíl od prvoků, živočichů atd. vládne mezi vyššími rostlinami telomerázová totalita.
Slovník termínů jako samostatný pdf soubor vložem níže pod obrazovou galerií.
Citovaná a použitá literatura
PEŠKA, Vratislav, et al. Characterisation of an unusual telomere motif (TTTTTTAGGG)n in the plant Cestrum elegans (Solanaceae), a species with a large genome. The Plant Journal, 2015, 82.4: 644-654.
PEŠKA, Vratislav, et al. BAL31-NGS approach for identification of telomeres de novo in large genomes. Methods, 2017, 114: 16-27.
SYKOROVA, Eva, et al. The absence of Arabidopsis‐type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae): first evidence from eudicots. The Plant Journal, 2003, 34.3: 283-291.
SÝKOROVÁ, E., et al. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 2003, 270.1527: 1893-1904.
Internetové odkazy:
V červenci 1938 publikovala B. McClitocková poznatky o koncových fúzích na zlomených chromozomech kukuřice seté (Zea mays).
http://cdm16795.contentdm.oclc.org/cdm/ref/collection/agexptstn/id/67543
Nejdříve bylo potřeba vyjasnit, čím jsou geny tvořeny z biochemického hlediska, že jsou uloženy v DNA, a nikoli třeba v proteinech, což roku 1944 prokázali O. Avery, C. MacLeod a M. McCarty.
en.wikipedia.org/wiki/Avery%E2%80%93MacLeod%E2%80%93McCarty_experiment
Za objev, jak jsou chromozomy chráněny telomerami a telomerázou, byla v roce 2009 udělena E. H. Blackburnové, C. W. Greiderové a J. W. Szostakovi Nobelova cena.
www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2009/
Problematiku telomer u bezobratlých živočichů úspěšně v ČR objasňuje Laboratoř molekulární cytogenetiky Entomologického ústavu AV ČR, v. v. i., na pavoukovce se pak specializuje Laboratoř cytogenetiky pavoukovců PřF Univerzity Karlovy.
www.entu.cas.cz/uvodni-stranka/
www.natur.cuni.cz/biologie/genetika/veda-a-vyzkum-1/laborator-cytogenetiky-pavoukovcu?set_language=cs
Telomerovým sekvencím řas se na Biofyzikálním ústavu AV ČR, v. v. i., věnuje Eva Sýkorová a Jana Fulnečková.
www.ibp.cz/cs/
RepeatExplorer: http://repeatexplorer.org/
Tandem Repeats Finder: http://tandem.bu.edu/trf/trf.html
The second part of a trip to the end of the genome is focused on telomere sequence discovery. The principal of cloning approaches used in specific taxons is described here with emphasis on information involving plant telomeric motifs. Telomeres are maintained by an enzyme – telomerase. On the other hand, there is an increasing number of exceptions with telomerase-independent telomere lengthening systems like targeted retrotransposition in flies. Surprisingly, the last candidate for non-telomerase species in plants – the genus Allium – was also shown to have functional telomerase which produces a typical telomere minisatellite with changed motif with respect to plant consensus. So it seems that telomerase totally rules among Embryophyta.
-
Cibuloviny z rodu česnek (Allium) byly zatím poslední nadějí na zástupce suchozemských rostlin s jiným způsobem udržování konců molekul DNA než pomocí telomerázy. Ale i u nich se nakonec telomeráza produkující zvláštní a neobvykle dlouhý motiv našla (telomerový motiv rodu česnek CTCGGTTATGGG byl poprvé popsán v článku P. Fajkuse, V. Pešky a kol. 2016). Foto T. Mandáková, Mendelovo centrum, CEITEC Masarykova univerzita
-
Schematické znázornění identifikace první telomerové sekvence u prvoka vejcovky Tetrahymena thermophila. Tento druh vykazuje jaderný dimorfismus (a). Generativní jádro mikronukleus (mik) obsahuje 2n = 10 chromozomů s jediným párem bloků rRNA genů – naznačeno červeně (b). Somatické jádro (makronukleus – mak) obsahuje desítky tisíc kopií rDNA (c), které mají jednotnou restrikční mapu a jejich konce jsou opatřeny telomerami (d). Koncové restrikční fragmenty rDNA lze poznat a oddělovat na základě velikosti a značení, což byl velký pokrok směrem k objasnění jejich sekvence (e). Blíže v textu. Orig V. Peška
-
Strategie pro transplantaci telomer z Tetrahymena thermophila do kvasinkových plazmidů a identifikace telomerové DNA u Saccharomyces cerevisiae. Běžně používaný plazmid byl napřímen restriktázou BamHI (a) a jeho konce spojeny s koncovými restrikčními fragmenty ribozomové DNA (rDNA) z prvoka s funkční telomerovou sekvencí (b, černé šipky na konci úseček). Schéma výsledku separace fragmentů DNA v gelu pomocí elektroforézy (c). Bílé obdélníky představují startovní jamky, kam se nanáší vzorek DNA. Po čase nejkratší fragmenty doputují od startu nejdále, nejdelší fragmenty zůstávají těsně za jamkami. Cirkulární plazmid izolovaný z buněk vytváří podle struktury a konformace v elektroforetickém gelu hned několik oddělených proužků (černé pruhy) – dráha 1. Genomová DNA hostitelské buňky zůstává v tzv. kompresní zóně (šedý pruh) – dráha 1 a 3. Izolovaný, dokonale přečištěný a natažený plazmid vytváří jediný proužek, který velikostně odpovídá jedné z konformací v dráze 1 – silný černý proužek v dráze 2. Plazmidy, které bylo možné i po mnoha generacích z kvasinek izolovat jako lineární formy, musely nést funkční telomery. Byly to právě plazmidy s transplantovanými telomerami z prvoků. Při separaci v gelu stále vytvářely jediný pruh oddělený od genomové DNA, nevyskytovaly se v jiných, především cirkulárních konformacích – dráha 3. Buňky s plazmidy bez transplantovaných telomer nepřežívaly větší počet generací nebo se zachránily začleněním plazmidu, který má vlastní telomery, do svého genomu. Plazmidový signál pak byl ve stejné pozici jako genomová DNA hostitelské buňky. Dráha 4 – plazmid začleněný do genomu hostitelské buňky poskytuje signál odpovídající pozici DNA v kompresní zóně. Po několikaměsíčním udržování kultur s transplantovanými telomerami se nakonec ukázalo, že tyto telomery zůstávají stabilní (d). Plazmid byl stále zjistitelný jako fragment DNA v dráze 2 a dokonce i prodloužený o novou telomerovou sekvenci, která už nepocházela z prvoků, ale patřila kvasinkám (červené šipky na konci konstruktu). Orig V. Peška
-
Porovnání klonů lidské genomové DNA a klonů z křečíka čínského (Cricetulus griseus). Když ze shodných vyloučíme rDNA, zůstává pouze omezený počet kandidátních telomerových klonů. Orig V. Peška
-
Strategie klonování telomerové DNA u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). Na začátku pokusu (a, b) byly připraveny dvě sady (molekulární biologové říkají knihovny) klonů genomové DNA huseníčku rolního. Tyto dvě knihovny byly sestaveny tak, že se po specifickém převedení fragmentů rostlinné DNA na jednořetězcové formy regenerovaly především molekuly obsahující repetitivní genomovou DNA (c). V knihovně obohacené o repetice byl dále hledán klon, který by poskytl signál typický pro telomerovou DNA v tzv. BAL31 testu. Test citlivosti kandidátní sekvence ke štěpení enzymem BAL31 (d) je modifikovanou verzí Southernovy hybridizace, ve které se před použitím restrikčního enzymu na vzorky genomové DNA působí BAL31 různě dlouhou dobu (např. 0 min, 5 min a 20 min). Preferenčně se tak zkracují telomerové sekvence. Ostatní genomová DNA je následně fragmentována a z telomerové sekvence odsekána restriktázou, která telomerovou sekvenci neštěpí. Při konečné hybridizaci s telomerovou sondou lze v závislosti na délce působení nukleázy BAL31 u telomerových fragmentů zaznamenat jejich zkracování a celkový úbytek signálu. Pokud se jako sonda použije netelomerová DNA, např. centromerová repetice, signál zůstává stejný ve všech vzorcích bez ohledu na délku štěpení pomocí BAL31. Blíže v textu. Klon, který poskytuje zkracující se signál, je tak dobrým kandidátem na telomerovou DNA. Enzym exonukleáza BAL31 štěpí konce všech fragmentů (tj. telomerové i netelomerové DNA), ale pouze telomerová DNA je takto štěpena vždy a systematicky. Netelomerová DNA je zkracována pomocí BAL31 jen vzácně a náhodně, např. pokud došlo k náhodnému zlomu DNA při její izolaci. Z toho důvodu se netelomerové sekvence na rozdíl od telomerových s prodlužováním působení enzymu BAL31 nezkracují. Orig V. Peška
-
Schéma BAL31-NGS strategie pro získání telomerových kandidátů (NGS – Next Generation Sequencing). Postup má tři fáze. Nejprve je potřeba připravit DNA pro tvorbu sekvenačních knihoven. Paralelně se připraví dva vzorky vysokomolekulární DNA, z nichž jeden je čistá genomová DNA a druhý rovněž genomová DNA, ale ošetřená nukleázou BAL31. Následuje fáze sekvenace, která zahrnuje přípravu sekvenačních knihoven a samotnou sekvenaci. V třetí fázi se pomocí bioinformatických nástrojů ze získaných NGS dat identifikují repetice se sníženým výskytem v datasetu odpovídajícím vzorku štěpenému pomocí BAL31. Orig V. Peška
-
Jeden z námi studovaných druhů česnek medvědí (Allium ursinum) – vytrvalá bylina vysoká 10–40 cm, s přízemními řapíkatými listy, jejichž čepele jsou úzce eliptické až úzce vejčité, 10–20 cm dlouhé a 2–5 cm široké. Je oblíbený v lidovém léčitelství a používá se i při vaření. Nejčastěji se vyskytuje v lužních a listnatých lesích, kde vytváří souvislé porosty. Není chráněný, ale je třeba upozornit na možnost porušení zákonných ustanovení, hlavně při jeho sběru ve zvláště chráněných územích, např. v přírodních rezervacích. Foto V. Peška
-
Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) jako důkaz telomerové lokalizace kandidátní sekvence u kladivníku nádherného (Cestrum elegans). Červeně zobrazeny jeho mitotické chromozomy (2n = 16, 20 Gb; obarvené pomocí fluorescenčního barviva DAPI specifického pro veškerou DNA) a zeleně signál poskytnutý fluorescenčně značenou sondou odvozenou od motivu (TTTTTTAGGG)n. Foto V. Peška
-
Genomová hybridizace in situ (GISH) slouží jako nástroj pro zjištění lokalizace společných repetic. Modře jsou zobrazeny mitotické chromozomy česneku medvědího (Allium ursinum, 2n = 14, 64 Gb; obarvené DAPI) a červený signál pochází z genomové sondy cibule kuchyňské (A. cepa) odrůdy ′Všetana′. Velké červené bloky odpovídají rDNA a slabší dvojité signály na koncích chromozomů naznačují přítomnost neznámé, ale společné repetitivní telomerové sekvence pro oba druhy. Foto V. Peška
-
Výsledek získaný cytogenetickou metodou FISH – důkaz telomerové lokalizace kandidátní sekvence u česneku medvědího (Allium ursinum). Červeně mitotické chromozomy (obarveno DAPI) a zeleně signál poskytnutý fluorescenčně značenou sondou odvozenou od motivu (CTCGGTTATGGG)n. Foto V. Peška
Výsledek získaný cytogenetickou metodou FISH – důkaz telomerové lokalizace kandidátní sekvence u česneku medvědího (Allium ursinum). Červeně mitotické chromozomy (obarveno DAPI) a zeleně signál poskytnutý fluorescenčně značenou sondou odvozenou od motivu (CTCGGTTATGGG)n. Foto V. Peška
