Vědecká činnost centra Studia Rudolphina se zaměřuje na osobnost císaře Rudolfa II. jako sběratele a mecenáše a na umění a kulturu s ním spojenou, tj. zejména na císařské sbírky a dvorské umělce. Úkolem centra je podporovat výzkum tématu u odborné veřejnosti a poskytovat zázemí českým i zahraničním studentům a badatelům. Výsledky mezinárodního výzkumu jsou jednou ročně publikovány v Bulletinu Studia Rudolphina. Rudolfinským badatelům umožňujeme prezentaci v rámci ústavního cyklu přednášek Collegium Historiae Artium. Doktorandi i badatelé všech profesních stupňů mohou pro pobyt v délce 15–30 dní využít Stipendium Josefa Dobrovského, které je třeba podat na konci října každého roku. Studentům a začínajícím badatelům v rudolfínském umění poskytuje Centrum také možnost využít krátkodobé Stipendium Kateřiny Duškové. Zájemci o stipendia mohou kontaktovat Sylvu Dobalovou dobalova@udu.cas.cz.
Centrum bylo založeno v roce 2000. Navázalo tím na soustavně prováděný výzkum rudolfínského umění, započatý na půdě ÚDU AVČR v šedesátých letech 20. století. Jeho prvním mezinárodním úspěchem bylo vytvoření stálé expozice obrazárny Pražského hradu a s ní spojená mezinárodní konference (1965). Pracovníci ústavu se podíleli na přípravě dalších stěžejních výstav s rudolfínskou tematikou (1988 Essen a 1997 Praha) a zorganizovali řadu mezinárodních konferencí. Připomenout lze např. výstavu Hans von Aachen (1552–1615): Malíř na evropských dvorech (Cáchy, Praha, Vídeň, 2010). U této příležitosti byla zorganizována mezinárodní konference, jejímž výstupem se stal sborník Hans von Aachen in Context (2012). Do činnosti centra spadá rovněž mapování kulturních vazeb panovnických dvorů ve střední Evropě. Těm byly zatím věnovány dvě konference a speciální čísla bulletinu München – Prag um 1600 (2007) a Dresden – Prag um 1600 (2017). Cílená pozornost je věnována také významu Rudolfa II. pro rozvoj novověkých věd, viz např. publikace Alchymie a Rudolf II. (2011, angl. verze 2017) nebo recentní Alchymické laboratorium v obrazových a textových pramenech (česká i anglická verze 2023). Mezi oblasti zájmu členů centra patří i bezprostřední předchůdci císaře Rudolfa II., zejména arcivévoda Ferdinand II. Tyrolský. Výstava jemu věnovaná se uskutečnila v letech 2017–2018 v Innsbrucku a v Praze za spolupráce ÚDU AVČR, Schloss Ambras Innsbruck a NG Praha. Výzkum kulturních aktivit arcivévody byl podpořen několika granty, které vyústily do knižního zpracování, např. Knihovna arcivévody Ferdinanda Tyrolského (2015); monografie o letohrádku Hvězda (2014; angl. verze 2017) nebo publikace Archduke Ferdinand II of Austria: Second Born Son in Renaissance Europe (Vienna, 2021).
V současné době zpracovává tým centra Studia Rudolphina výsledky dosažené během grantu GAČR č. 20-15927S (2020–2022) Umění na odiv: obrazová sbírka císaře Rudolfa II. v kontextu uměleckého sběratelství kolem roku 1600. Projekt se věnuje studiu a interpretaci inventářů zaznamenávajících císařovu obrazovou kolekci, stejně jako otázce rozmístění sbírky v prostorech Pražského hradu. V přípravě je knižní publikace a také databáze inventárních položek císařovy obrazárny.