Metabolismus a fyziologické funkce cytokininů
Vypracovali jsme zjednodušený model metabolické regulace hladin cytokininů v rostlinných buňkách, který objasňuje mechanismy navození dočasných změn poměrů hladin cytokininů a jiných fytohormonů, zejména auxinů, vedoucí k indukci specifických morfogenních procesů (diferenciace různých orgánů) a k následnému ustavení hormonální rovnováhy (homeostáze) potřebné k dokončení vývoje iniciovaných struktur (Kamínek et al., Physiologia Plantarum 1997, 2003). Ve spolupráci se Skupinou matematického modelování jsme rovněž vypracovali komplexní model metabolických přeměn cytokininů zahrnující všechny dosud známé enzymové dráhy identifikované v rostlinách Arabidopsis thaliana (obr. 1). Parametry tohoto modelu se v současné době dále optimalizují, přičemž je posuzována zejména možnost jeho využití při ověřování nejrůznějších hypotéz spojených s biosyntézou a metabolismem cytokininů v rostlinách.
Model metabolické regulace hladin cytokininů v poměru k auxinu a jejího významu při indukci a následném vývoji indukovaných fyziologických procesů (Kamínek et al., Physiol. Plant. 117: 453–458, 1997, aktualizováno). CK – cytokinin, CKX – CKoxidáza/dehydrogenáza, CBP – vazebný protein pro CK, iPMP – isopentenyladenosin-monofosfát, IPT – isopentenyltransferáza
Platnost tohoto modelu experimentálně ověřujeme jak v kulturách rostlinných buněk a pletiv in vitro, tak i v intaktních rostlinách, u nichž je obsah nativních cytokininů experimentálně pozměněn exogenní aplikací jak přirozených, tak syntetických cytokininů (Motyka et al., Physiologia Plantarum 2003), expresí genů kódujících enzymy zapojené do regulace hladin prekursorů (farnesyldifosfátsyntáza; Manzano et al., Plant Molecular Biology 2006), expresí genů kódujících enzymy zapojené do biosyntézy (isopentenyltransferáza; Galichet and Hoyerová et al., Plant Physiology 2008; Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008; Yevdakova et al., Journal of Plant Growth Regulation 2008) a degradace (cytokininoxidáza/dehydrogenáza; Werner et al., PNAS 2001 ; Werner et al., Plant Cell 2003; von Schwartzenberg et al., Plant Physiology 2007; Mýtinová and Motyka et al., Journal of Plant Growth Regulation 2011; Raspor and Motyka et al., Journal of Plant Growth Regulation 2012) cytokininů a do přenosu cytokininového signálu (Frank et al., Plant Physiology 2000). Pokusy s mutanty modelových rostlin Arabidopsis thaliana a mechu Physcomitrella patens jsme potvrdili, že změny fenotypu odrážejí změny poměrných koncentrací cytokininů a auxinů, jakož i změny v expresi genů a aktivitách příslušných enzymů (Yevdakova et al., Journal of Plant Growth Regulation 2008; Dwivedi et al., Plant Growth Regulation 2010).
Při zdokonalování metod analýzy rostlinných hormonů jsme společně a Analytickou jednotkou laboratoře vyvinuli novou extrakční a purifikační metodu umožňující separaci auxinu a kyseliny abscisové od cytokininů (Dobrev a Kamínek, Journal of Chromatography A 2002) a jejich spolehlivou identifikaci a kvantifikaci pomocí dvourozměrné HPLC (Dobrev et al., Journal of Chromatography A 2005). Zhodnotili jsme účinnost používaných metod extrakce a čištění cytokininů a optimalizovali postup snižující obsah interferujících látek a tím zvyšující odezvy značených interních standardů při analýze cytokininů pomocí hmotnostní spektrometrie (Hoyerová et al., Phytochemistry 2006). Vypracovali jsme rovněž metodiku umožňující současné stanovení enzymových aktivit cytokininoxidázy/dehydrogenázy a zeatinreduktázy v rostlinných pletivech a objasnili jejich úlohu při zachování hormonální homeostáze (Gaudinová et al., Journal of Plant Growth Regulation 2005).
S využitím různých modelových rostlin jsme rozšířili znalosti o fyziologické úloze cytokininů při řízení rostlinné organogeneze (Sriskandarajah et al., Journal of Plant Growth Regulation 2006; Klemš et al., Plant Growth Regulation 2011), senescence (Ananieva et al., Physiologia Plantarum 2004a; 2004b; 2008 a Plant Growth Regulation 2011; Conrad et al., Physiologia Plantarum 2007), při regulaci příjmu a využití minerálního dusíku (Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008) a odezvy rostlin na biotický (Behr and Motyka et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 2012) a (ve spolupráci se Skupinou úlohy fytohormonů v interakci s prostředím) i na abiotický stres (Havlová et al., Plant, Cell and Environment 2008; Dobrá et al., Journal of Plant Physiology 2010; Mýtinová and Motyka et al., Biologia Plantarum 2010; Kosová et al., Journal of Plant Physiology 2012; Djilianov and Dobrev et al., Journal of Plant Growth Regulation 2013).
Společně s ostatními členy Laboratoře hormonálních regulací u rostlin jsme vypracovali návrh systému zkratek purinových cytokininů (Kamínek et al.; Plant Growth Regulation 2000) a podíleli se na přípravě pravidel upravujících názvosloví proteinů dvoukomponentního systému uplatňujícího se např. při přenosu cytokininového signálu v rostlinách (Heyl et al., Plant Physiology 2013).
V současné době se vedle výše zmíněných aktivit věnujeme poznání metabolismu a fyziologických funkcí cytokininů cis-zeatinového typu (Gajdošová and Spíchal et al., Journal of Experimental Botany 2011; Stirk et al., Journal of Plant Growth Regulation 2012; Behr and Motyka et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 2012) a metabolické regulace hladin cytokininů v rostlinách během jejich transportu (Kašík et al., Anal Bioanal Chem 2010). Rovněž nás zajímá potenciální využití získaných poznatků pro zvyšování odolnosti (Zhang et al., Zhang et al., Journal of Integrative Plant Biology 2010) a produktivity (Sýkorová et al., Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008) hospodářsky významných plodin.
Na řešení uvedené problematiky spolupracujeme s řadou institucí jako např. Institute of Plant Sciences, ETH Zurich, Switzerland (Prof. W. Gruissem); National Laboratory of Plant Molecular Genetics, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (Prof. P. Zhang); Biozentrum Klein Flottbek, Universität Hamburg, Germany (Dr. K. von Schwartzenberg); Research Centre for Plant Growth and Development, University of KwalaZulu-Natal, Pietermaritzburg, South Africa (Dr. W. Stirk, Prof. J. van Staden); Acad. M. Popov Institute of Plant Physiology, Bulgarian Academy of Sciences, Sofia, Bulgaria (Dr. K. Ananieva, Prof. E. D.Ananiev); , Institut de la terre et de la Vie, Université catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium (Prof. S. Lutts); Institute for Biological Research, University of Belgrade, Serbia (Dr. I. Dragićević); Interdisziplinäres Zentrum für Nutzpflanzenforschung, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Germany (Dr. S. Wirsel); Division of Biology Imperial College London, UK (Dr. C. Turnbull), Institute of Botany, University of Basel, Switzerland (Dr. D. Hann) i s dalšími kolegy doma i v zahraničí.