Funkce a struktura buněčných membrán
Garant: RNDr. Hana Sychrová, DrSc
Přednášející: RNDr. Petr Ježek, DrSc., Prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc., Doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Ing. Olga Zimmermannová, PhD., RNDr. Marie Kodedová, PhD., RNDr. Hana Sychrová, DrSc., Mgr. Jaromír Zahrádka, RNDr. Lydie Plecitá, PhD., David Reguera, PhD., Ing. Jaroslav Zelenka, PhD., Ing. Tomáš Špaček, PhD., Mgr. Katarína Smolková, PhD.
Téma:V rámci kurzu budou účastníci seznámeni s nejnovějšími poznatky v oblasti buněčné membranologie a s možnostmi různých metodických přístupů (s důrazem na moderní fluorescenční a zobrazovací techniky) pro studium biologických procesů, kterých se účastní plazmatická membrána buněk i membrány vnitrobuněčných organel, zejména mitochondrií.
Kurz je rozvržen do 5 dní, dopoledne proběhnou vždy 2-3 přednášky v rámci jednoho tematického bloku (celkem 4 bloky) a odpoledne bude věnováno praktickým laboratorním ukázkám a cvičením (5 x), poslední odpoledne bude věnováno písemnému testu, diskusi, analýze výsledků praktických cvičení a zhodnocení kurzu. Pro praktická cvičení budou účastníci rozděleni do malých skupin tak, aby si během praktických cvičení mohli vyzkoušet všechny metodické přístupy a techniky.
Témata přednáškových bloků (vždy 2-3 přednášky v rámci bloku):
Buněčné membrány
Složení struktura a funkce membrán, buněčné transportní systémy - biochemické a biofyzikální přístupy k jejich studiu, vnitrobuněčné organely a úloha jejich membrán
Fluoresceční techniky v moderní biologii
Základy fluorescenčních technik, fluorescenční techniky v biologii, měření membránového potenciálu a vnitrobuněčného pH, studium interakce proteinů in vivo
Mitochondriální integrovaná fyziologie
Mitochondrie - významná součást buněčné fyziologie, mitochondrie a regulace rovnováhy reaktivních kyslíkových sloučenin, mitochondriální DNA
Trojdimenzionální fluorescenční mikroskopie a nanoskopie
Metody superrozlišující fluorescenční mikroskopie. Aplikace 3D nanoskopie na studie mitochondrií.
Témata praktických cvičení:
Fyziologické projevy absence membránových transportérů – základní biologické pokusy srovnávající fenotypy buněk lišících se ve spektru transportních systémů; identifikace mutantních buněk s poškozenými či naopak nadměrně aktivními transportéry pro kationty alkalických kovů; stanovení osmotolerance a osmosensitivity.
Stanovení relativního membránového potenciálu – základní fluorescenční techniky pro stanovení relativního membránového potenciálu (hyperpolarizace, hypopolarizace); používání fluorescenčních sond in vivo; pozorování změn membránového potenciálu po aplikaci různých chemických látek.
Stanovení vnitrobuněčného pH in vivo – heterologní exprese pHluorinu pro stanovení vnitrobuněčného pH; tvorba kalibračních křivek; klasická fluorescenční spektroskopie vs. fluorescenční mikroskopie vs. fluorescenční reader; stanovení vnitrobuněčného pH v mutantních kmenech kvasinek postrádajících různé transportéry s využitím readeru a 96-jamkových destiček.
Precizní respirometrie - základy kalibrace oxygrafu; základní bioenergetický test buňky; měření kinetiky; měření hypoxicky adaptovaných buněk.
Trojdimenzionální fluorescenční mikroskopie a nanoskopie - základy práce na konfokálním mikroskopu; tvorbu konstruktů a transfekce buněk konjugáty fotokonvertibilních fluorescenčních proteinů; základní měření na BiplaneFPALM mikroskopu; výpočty lokalizací ve 3D a analýzu 3D obrazů.