Metabolismus a fyziologické funkce cytokininů
Vypracovali jsme zjednodušený model metabolické regulace hladin cytokininů v rostlinných buňkách, který objasňuje mechanismy navození dočasných změn poměrů hladin cytokininů a jiných fytohormonů, zejména auxinů, vedoucí k indukci specifických morfogenních procesů (diferenciace různých orgánů) a k následnému ustavení hormonální rovnováhy (homeostáze) potřebné k dokončení vývoje iniciovaných struktur (Kamínek et al., Physiologia Plantarum 1997, 2003). Ve spolupráci se Skupinou matematického modelování jsme rovněž vypracovali komplexní model metabolických přeměn cytokininů zahrnující všechny dosud známé enzymové dráhy identifikované v rostlinách Arabidopsis thaliana (obr. 1). Parametry tohoto modelu se v současné době dále optimalizují, přičemž je posuzována zejména možnost jeho využití při ověřování nejrůznějších hypotéz spojených s biosyntézou a metabolismem cytokininů v rostlinách.
Model metabolických přeměn cytokininů zahrnující všechny dosud známé enzymové dráhy identifikované v rostlinách Arabidopsis thaliana (podle Hošek a Hoyerová). iP = N6-(∆2-isopentenyl)adenin; tZ = trans-zeatin; DHZ = dihydrozeatin; cZ = cis-zeatin; -R = –9-ribosid; -RP = –9-ribosid-5´-fosfát; -OG = -O-glukosid; -N7G = -N7-glukosid; -N9G = -N9-glukosid; DMAPP = dimetylalyl difosfát; CKX = cytokininoxidasa/dehydrogenasa, IPT = isopentenyltransferasa; APT = adenin fosforibosyltransferasa; LOG = cytokinin fosforibohydrolasa „Lonely Guy“; ADK = adenosin kinasa; CYP = cytochrom P450 monooxygenasa; UGT – N-glukosyltransferasa
Platnost tohoto modelu experimentálně ověřujeme jak v kulturách rostlinných buněk a pletiv in vitro, tak i v intaktních rostlinách, u nichž je obsah nativních cytokininů experimentálně pozměněn exogenní aplikací jak přirozených, tak syntetických cytokininů (Motyka et al., Physiologia Plantarum 2003), expresí genů kódujících enzymy zapojené do regulace hladin prekursorů (farnesyldifosfátsyntáza; Manzano et al., Plant Molecular Biology 2006), do biosyntézy (isopentenyltransferáza; Galichet and Hoyerová et al., Plant Physiology 2008; Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008; Yevdakova et al., Journal of Plant Growth Regulation 2008; Žižková et al., BMC Plant Biology 2015) a degradace (cytokininoxidáza/dehydrogenáza; Werner et al., PNAS 2001; Werner et al., Plant Cell 2003; von Schwartzenberg et al., Plant Physiology 2007; Mýtinová and Motyka et al. Biologia Plantarum 2010; a Journal of Plant Growth Regulation 2011; Raspor and Motyka et al., Journal of Plant Growth Regulation 2012; Trifunović et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 2013; Trifunović and Motyka et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 2015) cytokininů a do přenosu cytokininového signálu (Frank et al., Plant Physiology 2000). Pokusy s mutanty modelových rostlin Arabidopsis thaliana a mechu Physcomitrella patens jsme potvrdili, že změny fenotypu odrážejí změny poměrných koncentrací cytokininů a auxinů, jakož i změny v expresi genů a aktivitách příslušných enzymů (Yevdakova et al., Journal of Plant Growth Regulation 2008; Dwivedi et al., Plant Growth Regulation 2010).
Značnou pozornost věnujeme poznání výskytu, metabolismu a fyziologických funkcí dosud poněkud opomíjené a přehlížené skupiny cytokininů cis-zeatinového typu. Prokázali jsme hojné zastoupení těchto derivátů napříč celou rostlinnou říší (Gajdošová and Spíchal et al., Journal of Experimental Botany 2011; Záveská Drábková et al., PLoS One 2015) a demonstrovali jejich biologickou aktivitu a metabolické přeměny (Gajdošová and Spíchal et al., Journal of Experimental Botany 2011) jakož i možnou fyziologickou funkci při regulaci rostlinného vývoje (Stirk et al., Journal of Plant Growth Regulation 2012 a Journal of Plant Physiology 2012) a při modulaci obranných reakcí rostlin vůči abiotickým stresům (Havlová et al., Plant Cell and Environment 2008; Dobrá et al., Journal of Plant Physiology 2010; Kosová et al., Journal of Plant Physiology 2012; Macková et al., Journal of Experimental Botany 2013) a patogenní infekci (Behr and Motyka et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 2012).
Při zdokonalování metod analýzy rostlinných hormonů jsme společně s Analytickou jednotkou laboratoře vyvinuli novou extrakční a purifikační metodu umožňující separaci auxinu a kyseliny abscisové od cytokininů (Dobrev a Kamínek, Journal of Chromatography A 2002) a jejich spolehlivou identifikaci a kvantifikaci pomocí dvourozměrné HPLC (Dobrev et al., Journal of Chromatography A 2005). Zhodnotili jsme účinnost používaných metod extrakce a čištění cytokininů a optimalizovali postup snižující obsah interferujících látek a tím zvyšující odezvy značených interních standardů při analýze cytokininů pomocí hmotnostní spektrometrie (Hoyerová et al., Phytochemistry 2006). Zároveň jsme se podíleli na miniaturizaci analytického postupu umožňujícího stanovovat již ve velmi malých navážkách rostlinných vzorků (desítky miligramů) současně s cytokininy celou řadu dalších fytohormonů jako např. auxiny, kyselinu abscisovou a salicylovou, gibereliny a jasmonáty včetně jejich metabolitů a prekurzorů (Djilianov and Dobrev et al., Journal of Plant Growth Regulation 2013). Vypracovali jsme rovněž metodiku umožňující současné stanovení enzymových aktivit cytokininoxidázy/dehydrogenázy a zeatinreduktázy v rostlinných pletivech a objasnili jejich úlohu při zachování hormonální homeostáze (Gaudinová et al., Journal of Plant Growth Regulation 2005).
S využitím různých modelových rostlin jsme rozšířili znalosti o fyziologické úloze cytokininů při řízení rostlinné organogeneze (Sriskandarajah et al., Journal of Plant Growth Regulation 2006; Klemš et al., Plant Growth Regulation 2011; Ćosić and Motyka et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 2015), senescence (Ananieva et al., Physiologia Plantarum 2004a; 2004b; 2008 a Plant Growth Regulation 2011; Conrad et al., Physiologia Plantarum 2007 a South African Journal of Botany 2015; Rubia et al., Journal of Plant Growth Regulation 2014; Uzelac et al., Protoplasma 2015), klíčení (Stirk et al., Journal of Plant Physiology 2012 a Journal of Plant Growth Regulation 2012) a při regulaci příjmu a využití minerálního dusíku (Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008).
Společně s ostatními členy Laboratoře hormonálních regulací u rostlin jsme vypracovali návrh systému zkratek purinových cytokininů (Kamínek et al.; Plant Growth Regulation 2000) a podíleli se na přípravě pravidel upravujících názvosloví proteinů dvoukomponentního systému uplatňujícího se např. při přenosu cytokininového signálu v rostlinách (Heyl et al., Plant Physiology 2013).
V současné době se vedle výše zmíněných aktivit věnujeme poznání metabolické regulace hladin cytokininů v rostlinách během jejich transportu (Kašík et al., Anal Bioanal Chem 2010), při zakládání a tvorbě květních orgánů (Quinet et al., Journal of Experimental Botany 2014) a při vytváření a změnách rezistence vůči bakteriálním patogenům (Hann et al., New Phytologist 2014). V neposlední řadě se podílíme na sledování regulačních funkcí transkripčních faktorů v korelaci s fytohormony při řízení rostlinného vývoje a reakce na zasolení (Hichri et al., Plant Physiology 2014 a Plant Cell and Environment 2015). Rovněž nás zajímá potenciální využití získaných poznatků pro zvyšování odolnosti (Zhang et al., Journal of Integrative Plant Biology 2010) a produktivity (Sýkorová et al., Journal of Experimental Botany 2008; Rubia et al., Journal of Plant Growth Regulation 2014) hospodářsky významných plodin.
Na řešení uvedené problematiky spolupracujeme s řadou institucí jako např. Institute of Plant Sciences, ETH Zurich, Switzerland (Prof. W. Gruissem); National Laboratory of Plant Molecular Genetics, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (Prof. P. Zhang); Biozentrum Klein Flottbek, Universität Hamburg, Germany (Dr. K. von Schwartzenberg); Research Centre for Plant Growth and Development, University of KwalaZulu-Natal, Pietermaritzburg, South Africa (Dr. W. Stirk, Prof. J. van Staden); Institute of Organic Chemistry with Centre of Phytochemistry, Bulgarian Academy of Sciences, Sofia, Bulgaria (Dr. K. Danova); Acad. M. Popov Institute of Plant Physiology, Bulgarian Academy of Sciences, Sofia, Bulgaria (Dr. K. Ananieva, Prof. E. D.Ananiev); , Institut de la terre et de la Vie, Université catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium (Prof. S. Lutts, Dr. I. Hichri, Dr. M. Quinet); Institute for Biological Research, University of Belgrade, Serbia (Dr. I. Dragićević); Interdisziplinäres Zentrum für Nutzpflanzenforschung, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Germany (Dr. S. Wirsel) a s dalšími kolegy doma i v zahraničí.